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1樓 2015-06-16 14:52:51

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王小燕30(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-17 22:48:21

我可以告訴你是由于你提取DNA沒(méi)提好，有一步是加NaOH為了溶解細(xì)胞，你這一步要不劇烈振蕩了要不就是時(shí)間太長(zhǎng)，強(qiáng)堿會(huì)使DNA斷裂成大小不一的片段而導(dǎo)致你拖尾。你退火溫度是68 是不是高了點(diǎn)呢？一般是TM值減5° 。

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10樓2015-06-17 11:00:20

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calorimetry

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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-19 20:46:35

我?guī)熃?凌波麗回復(fù)的。

長(zhǎng)程PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因與對(duì)策（包括PCR原因和電泳原因）

凌波麗

長(zhǎng)程PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因：
一、PCR反應(yīng)的原因：
酶量過(guò)多，DNA模板量過(guò)大，dNTP濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多。DNA模板不純，PCR操作時(shí)有外源的DNA污染。
大于3kb的DNA一般用Long-Range PCR。Long-Range PCR的酶的保真性一般比較好，酶的保真問(wèn)題一般不會(huì)引起地毯帶或者涂帶。
二、電泳檢測(cè)出的問(wèn)題。
三、長(zhǎng)程PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的不太可能的原因是：
1.引物的專一性差一般會(huì)有異常擴(kuò)增帶，但是一般不會(huì)出現(xiàn)涂帶和地毯帶。
2.引物二聚體形成一般也只會(huì)出現(xiàn)異常擴(kuò)增帶，通常分子量很小，也不會(huì)出現(xiàn)一般不會(huì)出現(xiàn)涂帶和地毯帶。
3.Long-Range PCR的酶的保真性一般比較好，酶的保真性問(wèn)題一般不會(huì)引起地毯帶或者涂帶。

針對(duì)各種原因的相應(yīng)的對(duì)策有：
1.減少酶量分梯度上下調(diào)一調(diào)，可以參考說(shuō)明書。
2. 縮短PCR反應(yīng)的退火溫度時(shí)間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒(méi)有重新設(shè)計(jì)引物之前，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度提高1-3度。具體調(diào)節(jié)可以參考說(shuō)明書。
3.使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，這時(shí)，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個(gè)循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。具體調(diào)節(jié)可以參考說(shuō)明書。
4.可以改用巢式PCR。巢式PCR也有現(xiàn)成的試劑盒可以購(gòu)買。
5. 保證PCR反應(yīng)的DNA模板的質(zhì)量，要用電泳檢測(cè)一下分子量和純度，質(zhì)量不好則要重新提取和純化DNA模板；適當(dāng)增加DNA模板量，減少循環(huán)次數(shù)。還要注意模板DNA是否發(fā)生了降解。
6.操作時(shí)要防止外源DNA污染，尤其是用微量移液器時(shí)，要在消毒棉塞在“槍頭”與微量移液器的吸管之間，或者購(gòu)置專門的有在兩者之間有隔膜的專用微量移液器。
7.適當(dāng)減少DNA模板量，可以梯度減少。
8.適當(dāng)減少循環(huán)次數(shù)，一般也就循環(huán)25次就差不多了。

9.電泳檢測(cè)的原因：
還有一個(gè)原因，我過(guò)去一直沒(méi)有考慮到，因?yàn)樵?014年暑假里，凌波麗重新實(shí)際學(xué)習(xí)和操作了DNA分離提純（抽提和電泳），基因克隆和定量PCR等基本的分子生物學(xué)操作后想到的。
PCR本身么有問(wèn)題，問(wèn)題出在DNA電泳操作這一步。
DNA電泳拖尾
電壓過(guò)大，根據(jù)電泳槽設(shè)置合適的電壓；
緩沖溶液離子濃度過(guò)高，調(diào)整鹽濃度在0.1mol/L以下；
DNA上樣量過(guò)多，稀釋DNA樣品濃度或者減少上樣量；
DNA發(fā)生了降解，重新提取DNA，并且加入DNase的抑制劑或者足夠量的蛋白質(zhì)的變性劑或者蛋白酶K。
電泳用的瓊脂糖凝膠濃度與DNA的分子量不匹配，濃度度過(guò)小導(dǎo)致大小的DNA都穿透了凝膠。

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32樓2015-06-19 10:42:44

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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-19 20:46:15

你的模板是12000-13000bp，還有人讓你用2%的膠，2%的膠只能分離50-2000bp的模板，兼職是笑話，正確的膠濃度應(yīng)該是0.5%，還有你的模板較長(zhǎng)，普通的Taq 酶很難擴(kuò)增，一般的酶最多只能擴(kuò)增5kb以下，熱啟動(dòng)酶不過(guò)才能擴(kuò)增10kb，所以你要用專為長(zhǎng)片段擴(kuò)增生產(chǎn)的酶 LA Taq酶擴(kuò)增，還有，看你的圖，模板應(yīng)該是有問(wèn)題的，竟然從頭拖到尾，也很怪異了，還是重新考慮下模板，而且注意上樣量，模板，酶上樣量過(guò)多也會(huì)產(chǎn)生這種效果，引物次要考慮吧，只是出來(lái)?xiàng)l帶在考慮，

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王小燕30

todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful

24樓2015-06-18 10:03:51

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zhqingfang

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瓊脂糖凝膠濃度太小了，改用2%的濃度試試看

實(shí)驗(yàn)忙碌中

13樓2015-06-17 16:46:42

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wangs2004

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乍一看我以為日光燈呢,LZ的模板是不是壞掉了

15樓2015-06-17 19:43:26

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王小燕30(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-19 20:46:51

引用回帖:

20樓: Originally posted by 王平陽(yáng) at 2015-06-17 22:27:18
這個(gè)圖。。。。。。。太壯觀了，倚天出鞘啊！
言歸正傳。你這個(gè)應(yīng)該是膠的問(wèn)題，即使PCR失敗或者模板有問(wèn)題也不應(yīng)該是這種情況；建議按如下步驟排查：
1、直接用模板DNA跑電泳或者其他正常擴(kuò)增的小片段PCR產(chǎn)物（小 ...

沒(méi)仔細(xì)看，marker還是挺好的，PCR產(chǎn)物跑成這樣還真是頭一次見呢，這個(gè)帶這么亮，是不是模板太多了，我們做的PCR，模板終濃度是1 ng/uL到5 ng/uL之間的，你試試，然后可以降低引物濃度，預(yù)變性時(shí)間延長(zhǎng)，第一次見，我能想到的就這些啦

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王小燕30

沒(méi)有做不到，只有想不到！

21樓2015-06-17 22:33:40

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引用回帖:

17樓: Originally posted by 王小燕30 at 2015-06-17 22:13:11

估計(jì)是模版不好了...

加油吧

小建議,別拿槍混得太厲害,或者就不混,用手指彈彈管底就好了

22樓2015-06-18 00:34:43

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是不是模板被降解了，重新提下模板吧

25樓2015-06-18 10:10:52

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calorimetry

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樓主的PCR明顯的出現(xiàn)了涂帶，我大概知道原因。

我把你的問(wèn)題發(fā)給我美國(guó)的師姐（她就是本版的顧問(wèn) 凌波麗），我明天上午大概能夠得到她的回復(fù)（美國(guó)跟這里有數(shù)小時(shí)的時(shí)差），看她是否同意我的見解，明天或者回復(fù)你吧。

30樓2015-06-18 16:58:22

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calorimetry

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我的美國(guó)師姐回答的已經(jīng)夠全面，無(wú)論是PCR本身，還是DNA電泳，她還是說(shuō)準(zhǔn)備再查一下文獻(xiàn)在繼續(xù)討論。她7月就回國(guó)度假了，到時(shí)你可以直接與她討論。

33樓2015-06-19 10:45:37

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請(qǐng)?zhí)峁┓磻?yīng)體系和程序。讓大家參考參考

2樓2015-06-16 20:19:10

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mangool

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有可能是提取核酸的純度不好

3樓2015-06-16 20:33:08

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 晞朔 at 2015-06-16 20:19:10
請(qǐng)?zhí)峁┓磻?yīng)體系和程序。讓大家參考參考

我做的是長(zhǎng)距離PCR，要跑出的條帶是12000和11000，就是應(yīng)該是電泳圖上最上邊兩條marker之間的條帶。一直是拖尾。
三條引物是：（上游引物）P：5’一GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC-3’
（下游引物）Q：5'-GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA-3’
（下游引物）B：5’-CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTC CCC TCT CATA-3’；
反應(yīng)體系：引物P、Q、B(20 pmol／ul)分別2ul、1ul、1ul，模板基因組DNA 2ul(約100 ng)，TaKaRa LA Taq酶0．25ul(5 U／ul)，2×GC緩沖液I 12．5ul，dNTP 4ul，蒸餾水補(bǔ)足，總反應(yīng)體積25ul。
反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，前10個(gè)循環(huán)98℃變性10 s，68℃退火／延伸10 min，后20個(gè)循環(huán)98℃變性10 s，68℃延伸10 min 20s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。電泳：配制6g/L瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物5ul與6×上樣緩沖液1ul混勻上樣，在恒壓75 V電泳，成像
我就是想問(wèn)問(wèn)這樣拖帶可能跟什么關(guān)系最大

我做的時(shí)候就一直在變化引物濃度比例，和退火溫度。用梯度PCR儀做過(guò)，退火溫度從65、66、-69、70，也沒(méi)什么明顯的結(jié)果條帶哦

4樓2015-06-16 21:55:43

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引用回帖:

3樓: Originally posted by mangool at 2015-06-16 20:33:08
有可能是提取核酸的純度不好

你也在做實(shí)驗(yàn)時(shí)候見過(guò)這樣拖尾情況沒(méi)

5樓2015-06-16 21:57:19

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781055707

木蟲 (著名寫手)

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拖尾一般是mg離子濃度照成的，樓住可以用其他引物驗(yàn)證一下試劑。

[ 發(fā)自小木蟲客戶端 ]

采菊東籬下，悠然見南山。

6樓2015-06-17 00:18:23

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易水秋寒

銀蟲 (初入文壇)

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PCR擴(kuò)增時(shí)使用的buffer是配套的buffer嗎？正常LA Taq配套的是10xLA Taq buffer II。
適當(dāng)減少些引物添加量試試呢，感覺引物量偏多。

7樓2015-06-17 08:19:17

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肉肉肉.

鐵蟲 (小有名氣)

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哈哈哈哈樓主怎么做到的！哈哈哈哈哈

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8樓2015-06-17 10:24:43

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aoaoshch

木蟲 (小有名氣)

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王小燕30(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-17 22:49:42

感覺PCR體系可以適當(dāng)調(diào)整一下：
引物0.5 ul、0.25 ul、0.25 ul
模版10 ng
LA Taq 0.4 ul
98℃變性10 s，62℃退火20 s，延伸10 min

可以再試試哈