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thendlee

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[求助] 關(guān)于融合PCR的問(wèn)題

鄙人在做一個(gè)融合PCR，第一個(gè)片段約2KB，第二個(gè)片段約11KB，重合片段大約在80bp左右，我按照資料里介紹的方法，先分別P出兩個(gè)獨(dú)立的片段，然后再不加引物融合8--10個(gè)循環(huán)，最后拿中間產(chǎn)物加最上游和最下游的引物30循環(huán)，可是一直出不來(lái)結(jié)果，最后跑膠的時(shí)候（如圖）還是出現(xiàn)兩條獨(dú)立的條帶，加樣孔倒是特別亮，會(huì)不會(huì)融合出一條特別長(zhǎng)的片段呢？我將融合后的產(chǎn)物純化回收過(guò)，跑膠時(shí)上樣孔依然很亮，不知道是什么原因，求助各位大神。

注：孔1為15000的marker 孔2、3為融合PCR產(chǎn)物，孔4是另一個(gè)PCR產(chǎn)物的對(duì)照，以示別的加樣孔并不亮

不加引物的體系為：
片段1                      3微升
片段2                      6微升
dNTP                      4
PS buffer                10
水                26.5
primestar                0.5

98度10S 51.6度15S  72度10M  8個(gè)循環(huán)

加引物的體系
中間產(chǎn)物       5微升
dntp                      5
PS                         10
水             26.5
上游             1.5
下游             1.5
primestar                0.5

98度10秒 52度15秒 72度11分半

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1樓 2012-02-24 10:06:44

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feichen2008

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
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thendlee(金幣+2): ★有幫助 2012-03-01 15:48:13

兩個(gè)片段的濃度要大概一致，濃度不要太高，50ng足夠。另外長(zhǎng)片段不是很好擴(kuò)，最好選擴(kuò)長(zhǎng)片段的酶。祝好運(yùn)！

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2樓2012-02-24 11:15:23

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wen1023tao

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
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thendlee(金幣+2): ★有幫助說(shuō)實(shí)話我第一次做這個(gè)融合PCR的時(shí)候成功了但是一個(gè)星期之后再做卻怎么也出不來(lái)了 2012-03-01 15:49:16

建議不加引物不要51.6度那一步，PCR儀降溫很快，快速降溫會(huì)影響DNA復(fù)性，這可能就是造成加樣空里面沒(méi)有跑出來(lái)的原因。我做片段（8KB左右）融合時(shí)是把兩個(gè)片段一起加進(jìn)去做模板，直接做加引物PCR的那步，不過(guò)由于這個(gè)過(guò)程包括了不加引物的那步的退火，像你的都有80bp，所以退火溫度用高點(diǎn)，60度以上，也可以兩步，第一個(gè)有高溫度退火5個(gè)循環(huán)，后面再用低溫退火進(jìn)行擴(kuò)增。融合的兩個(gè)片段最好大小差不多，摩爾量也差不多，有助于融合成功。

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3樓2012-02-24 13:53:45

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thendlee

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2樓: Originally posted by feichen2008 at 2012-02-24 11:15:23:
兩個(gè)片段的濃度要大概一致，濃度不要太高，50ng足夠。另外長(zhǎng)片段不是很好擴(kuò)，最好選擴(kuò)長(zhǎng)片段的酶。祝好運(yùn)！

我做了許多梯度還是沒(méi)有出來(lái)

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4樓2012-03-01 15:47:57

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feichen2008

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4樓: Originally posted by thendlee at 2012-03-01 15:47:57:
我做了許多梯度還是沒(méi)有出來(lái)

有沒(méi)有換個(gè)酶試一下。

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5樓2012-03-02 09:19:56

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5樓: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:19:56:
有沒(méi)有換個(gè)酶試一下。

你的片段太大，能不能考慮用酶切位點(diǎn)連？

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6樓2012-03-02 09:22:16

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6樓: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:22:16:
你的片段太大，能不能考慮用酶切位點(diǎn)連？

我仔細(xì)看了你的RCR圖，你融合之后的片段大小應(yīng)該是13KB，你跑的帶的大小不是也接近15KB的帶了嗎？你可以把最上面一條帶回收回來(lái)測(cè)個(gè)序看看是不是你要的

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7樓2012-03-02 09:26:11

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thendlee(金幣+1): 2012-03-02 15:09:49

有的PCR儀有緩慢降溫程序，比如0.1度/s，適合overlap的退火

這個(gè)情況，片段如此長(zhǎng)，我也覺(jué)得該考慮其他方法了
可以把11kb的片段分幾段PCR出來(lái)，再一一拼起。
片段長(zhǎng)度差不多的可能更容易拼接。
也可以利用片段天生的酶切位點(diǎn)，把幾個(gè)片段連接。

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8樓2012-03-02 10:46:18

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thendlee

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5樓: Originally posted by feichen2008 at 2012-03-02 09:19:56:
有沒(méi)有換個(gè)酶試一下。

這個(gè)倒沒(méi)有準(zhǔn)備試一下

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9樓2012-03-02 15:05:47

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8樓: Originally posted by gongeleven at 2012-03-02 10:46:18:
有的PCR儀有緩慢降溫程序，比如0.1度/s，適合overlap的退火

這個(gè)情況，片段如此長(zhǎng)，我也覺(jué)得該考慮其他方法了
可以把11kb的片段分幾段PCR出來(lái)，再一一拼起。
片段長(zhǎng)度差不多的可能更容易拼接。
也可以利用 ...

我后面那個(gè)大片段其實(shí)就是酶切位點(diǎn)連的在與第一個(gè)片段連接的時(shí)候發(fā)現(xiàn)連不上去板上什么都不長(zhǎng) 所以才考慮融合PCR

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10樓2012-03-02 15:07:19

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