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thendlee金蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于融合PCR的問題
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鄙人在做一個(gè)融合PCR，第一個(gè)片段約2KB，第二個(gè)片段約11KB，重合片段大約在80bp左右，我按照資料里介紹的方法，先分別P出兩個(gè)獨(dú)立的片段，然后再不加引物融合8--10個(gè)循環(huán)，最后拿中間產(chǎn)物加最上游和最下游的引物30循環(huán)，可是一直出不來結(jié)果，最后跑膠的時(shí)候（如圖）還是出現(xiàn)兩條獨(dú)立的條帶，加樣孔倒是特別亮，會(huì)不會(huì)融合出一條特別長的片段呢？我將融合后的產(chǎn)物純化回收過，跑膠時(shí)上樣孔依然很亮，不知道是什么原因，求助各位大神。 注：孔1為15000的marker 孔2、3為融合PCR產(chǎn)物，孔4是另一個(gè)PCR產(chǎn)物的對(duì)照，以示別的加樣孔并不亮 不加引物的體系為： 片段1 3微升 片段2 6微升 dNTP 4 PS buffer 10 水 26.5 primestar 0.5 98度10S 51.6度15S 72度10M 8個(gè)循環(huán) 加引物的體系 中間產(chǎn)物 5微升 dntp 5 PS 10 水 26.5 上游 1.5 下游 1.5 primestar 0.5 98度10秒 52度15秒 72度11分半 |
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thendlee
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2樓2012-02-24 11:15:23
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【答案】應(yīng)助回帖
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thendlee(金幣+2): ★有幫助 說實(shí)話 我第一次做這個(gè)融合PCR的時(shí)候成功了 但是一個(gè)星期之后再做卻怎么也出不來了 2012-03-01 15:49:16
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thendlee(金幣+2): ★有幫助 說實(shí)話 我第一次做這個(gè)融合PCR的時(shí)候成功了 但是一個(gè)星期之后再做卻怎么也出不來了 2012-03-01 15:49:16
| 建議不加引物不要51.6度那一步，PCR儀降溫很快，快速降溫會(huì)影響DNA復(fù)性，這可能就是造成加樣空里面沒有跑出來的原因。我做片段（8KB左右）融合時(shí)是把兩個(gè)片段一起加進(jìn)去做模板，直接做加引物PCR的那步，不過由于這個(gè)過程包括了不加引物的那步的退火，像你的都有80bp，所以退火溫度用高點(diǎn)，60度以上，也可以兩步，第一個(gè)有高溫度退火5個(gè)循環(huán)，后面再用低溫退火進(jìn)行擴(kuò)增。融合的兩個(gè)片段最好大小差不多，摩爾量也差不多，有助于融合成功。 |
3樓2012-02-24 13:53:45
thendlee
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4樓2012-03-01 15:47:57
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