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tu475575025新蟲 (小有名氣)
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重疊PCR比想象中的詭異p幾十輪了始終沒有拿到大片段 已有5人參與
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本人做三個(gè)片段A（1000bp---B(2200bp)--C(900bp)的融合pcr，先常規(guī)分別回收A、B、C，同源臂19-20bp,重疊之前都是模板互為引物先跑10個(gè)循環(huán)，再以這些pcr產(chǎn)物為模板進(jìn)行重疊pcr。 詭異的是，重疊AB可得到單一的目的片段，重疊BC也可以得到單一的目的片段，ABC一起重或者以AB、BC為模板依然無法得到ABC。難道不能重疊4k以上的片段？盼同仁點(diǎn)化中~~~~~~~~~~~~~~ |
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你可以單獨(dú)得到AB或者BC，說明你片段中的重疊部分長(zhǎng)度啊，退火溫度等還是沒有問題的，比較可能的問題是模板的比例。 “ABC一起重或者以AB、BC為模板依然無法得到ABC” 如果是A,B,C重疊，你需要測(cè)量(OD260)或者跑膠定一下A,B,C的濃度，然后保證在重疊PCR的時(shí)候，三者的摩爾比為1:1:1。 如果是AB,BC重疊，也需要計(jì)算摩爾比例。注意，由于你ABC三個(gè)片段的長(zhǎng)度有差異，計(jì)算摩爾濃度的時(shí)候要按不同的長(zhǎng)度計(jì)算分子量。 此外，重疊PCR的時(shí)候，引物的濃度一定要低，使用普通引物濃度的1/10，會(huì)有助于你的重疊產(chǎn)物的擴(kuò)增。 另外，如果你實(shí)在是重疊不出來，還可以選擇B方案。 看你的圖譜，你應(yīng)該是選擇了SmaI + BamHI連接ABC拼接片段進(jìn)入載體，之所以拼接ABC是為了去除ABC片段中的BamHI/SmaI的酶切位點(diǎn)，如果是這樣的話，你可以不通過拼接，將ABC片段連入載體。 首先，載體SmaI + BamHI雙酶切，然后Klenow補(bǔ)平 之后，重新設(shè)計(jì)引物，直接PCR從A到C的片段，平末端連接進(jìn)入載體。 你需要注意兩個(gè)問題，平末端連接會(huì)有反向的可能，需要測(cè)序驗(yàn)證。 為了保證讀碼框的正確，你在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候需要考慮酶切片段補(bǔ)平后序列，以BamHI為例 5‘-GGATCC-3’ 3‘-CCTAGG-3’ 你需要看一下載體的序列，弄清楚酶切后載體還剩什么序列，如果酶切后載體為： 5‘-G 3’-CCTAG 補(bǔ)平后為： 5‘-GGATC 3'-CCTAG 為了保證讀碼框的正確性，你需要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候在引物5’或3'端（這個(gè)要根據(jù)你的情況，看BamHI在5‘還是3’引物）加個(gè)G（5‘）/C（3’）使得補(bǔ)平后依然是BamHI的酶切位點(diǎn)。 |
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tu47557502513樓2014-03-28 18:35:58
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3樓2014-03-27 10:23:25
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你這個(gè)情況確實(shí)比較tricky，有點(diǎn)碰運(yùn)氣的成分 換酶試試，Roche有個(gè)long template，我們實(shí)驗(yàn)室這種情況經(jīng)常用， 其他辦法還是有的，你看看能不能先分段克隆，然后再找重疊的酶切位點(diǎn)拼起來，這個(gè)勝算更大 |
2樓2014-03-27 09:43:59
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5樓2014-03-27 14:07:56
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14樓2014-03-28 21:25:18
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這確實(shí)是個(gè)辦法，是這么個(gè)情況：載體上可用位點(diǎn)很少，插入片段中間有一些克隆位點(diǎn)，所以這些位點(diǎn)不能用，我首先將一個(gè)片段F連到載體上，另外一共有5個(gè)片段要連到一起再與載體連接，因?yàn)檩d體上和片段上能用的酶切位點(diǎn)只有兩個(gè)，我就設(shè)計(jì)了D的上游加了一個(gè)載體上的位點(diǎn)，E的下游加一個(gè)中間酶切位點(diǎn)，DE重疊，然后就是A上游加與E相同的中間酶切位點(diǎn)，ABC重疊，C下游加載體上另一個(gè)酶切位點(diǎn)，最后將DE、ABC酶切后與載體連接形成 載體-DE-中間酶切位點(diǎn)-ABC-F-載體(如圖) 最后的載體差不多20k了，現(xiàn)在就是卡在ABC重不上了，還不知道這個(gè)方案是否能打通。 我用的是takara 的GXL高保真酶，也是可以擴(kuò)30k的一個(gè)酶。NEB的phusion成功率高嗎，想請(qǐng)教一下，你們用這個(gè)酶重過多大的？ MAP.jpg MAP1.jpg |
4樓2014-03-27 11:45:45
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