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tu475575025新蟲 (小有名氣)
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[求助]
重疊PCR比想象中的詭異p幾十輪了始終沒有拿到大片段 已有5人參與
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本人做三個片段A（1000bp---B(2200bp)--C(900bp)的融合pcr，先常規(guī)分別回收A、B、C，同源臂19-20bp,重疊之前都是模板互為引物先跑10個循環(huán)，再以這些pcr產(chǎn)物為模板進(jìn)行重疊pcr。 詭異的是，重疊AB可得到單一的目的片段，重疊BC也可以得到單一的目的片段，ABC一起重或者以AB、BC為模板依然無法得到ABC。難道不能重疊4k以上的片段？盼同仁點化中~~~~~~~~~~~~~~ |
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tu475575025
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這確實是個辦法，是這么個情況：載體上可用位點很少，插入片段中間有一些克隆位點，所以這些位點不能用，我首先將一個片段F連到載體上，另外一共有5個片段要連到一起再與載體連接，因為載體上和片段上能用的酶切位點只有兩個，我就設(shè)計了D的上游加了一個載體上的位點，E的下游加一個中間酶切位點，DE重疊，然后就是A上游加與E相同的中間酶切位點，ABC重疊，C下游加載體上另一個酶切位點，最后將DE、ABC酶切后與載體連接形成 載體-DE-中間酶切位點-ABC-F-載體(如圖) 最后的載體差不多20k了，現(xiàn)在就是卡在ABC重不上了，還不知道這個方案是否能打通。 我用的是takara 的GXL高保真酶，也是可以擴(kuò)30k的一個酶。NEB的phusion成功率高嗎，想請教一下，你們用這個酶重過多大的？ MAP.jpg MAP1.jpg |
4樓2014-03-27 11:45:45
biostar2009
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【答案】應(yīng)助回帖
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tu475575025(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵交流 2014-03-27 10:33:38
tu475575025: 金幣+10, ★有幫助, 謝謝建議 2014-04-05 19:10:25
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你這個情況確實比較tricky，有點碰運氣的成分 換酶試試，Roche有個long template，我們實驗室這種情況經(jīng)常用， 其他辦法還是有的，你看看能不能先分段克隆，然后再找重疊的酶切位點拼起來，這個勝算更大 |
2樓2014-03-27 09:43:59
d00614028
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3樓2014-03-27 10:23:25
d00614028
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5樓2014-03-27 14:07:56
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