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wanglixia815

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[求助] PCR的帶不清楚。。。大家?guī)兔纯磮D片，看看問題出在哪里了。。已有4人參與

我是菌根的。。。最近做PCR。。共做了三次了，，
最上邊的一張圖前八個(gè)是DNA樣，后邊兩個(gè)PCR產(chǎn)品，這次用的電壓是110V，跑了30min..體系是50ul.
primer 20uM 個(gè)1ul...MyTaq master Mix 25ul..DNA 6ul 和5ul..剩下的用PCR water補(bǔ)齊..電泳時(shí)加的量5ul PCR products..5 ul Orange G..
.第二張圖
其中兩個(gè)樣沒有條帶。。電壓85V。。25ul 體系。。前四個(gè)樣 primer各0.5ul (10uM)后四個(gè)樣 primer各0.5ul （20uM）..MyTaq master Mix;12.5ul,
1ul DNA 電泳 PCR products 3ul Orange G 3ul
第二張圖
。電壓85V。。25ul 體系。。 primer各0.5ul （20uM）..MyTaq master Mix;12.5ul, 1ul DNA 電泳 PCR products 2ul Orange G 2ul
我的體系設(shè)置由問題嗎？
還有就是我的MyTaq Master Mix...回來在室溫下呆了一天，會(huì)不會(huì)由影響。。謝謝各位了。。第一次做PCR

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有點(diǎn)矛盾。有點(diǎn)糾結(jié)

1樓 2014-03-28 02:40:01

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woolley

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-28 11:46:36

從你的描述來看，PCR的體系應(yīng)該沒有問題。
從膠圖來看，PCR的產(chǎn)物濃度應(yīng)該挺大的，你可以少上點(diǎn)樣品，或者進(jìn)行一下稀釋。
目前看來有問題的是你的染料，你每次是等體積加入Orange G，不知道這個(gè)是為啥？慣例？還是按照說明書來的？從你膠圖的條帶來看，比較可能的是染料加多了，加上PCR產(chǎn)物很多，所以條帶形狀不好看。
建議你首先試一下減少染料的量，你可以只添加1/2，1/4，1/8正常添加量的染料，看看PCR效果如何。

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2樓2014-03-28 09:16:55

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愛上魚……

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

條帶很深，是不是跑膠加樣加多了……

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懶病又犯了……

3樓2014-03-28 09:44:15

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wanglixia815

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2樓: Originally posted by woolley at 2014-03-28 09:16:55
從你的描述來看，PCR的體系應(yīng)該沒有問題。
從膠圖來看，PCR的產(chǎn)物濃度應(yīng)該挺大的，你可以少上點(diǎn)樣品，或者進(jìn)行一下稀釋。
目前看來有問題的是你的染料，你每次是等體積加入Orange G，不知道這個(gè)是為啥？慣例？還是 ...

恩，加燃料根據(jù)平時(shí)的慣例加得，他們做的DNA跑膠都是1⃣️比一加的，看起來沒有問題，我今天試試...謝謝拉。那你說我的產(chǎn)物可以去測(cè)序嗎

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4樓2014-03-28 13:59:27

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3樓: Originally posted by 愛上魚…… at 2014-03-28 09:44:15
條帶很深，是不是跑膠加樣加多了……

我第一次➕的5ul，現(xiàn)在改道2ul了

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5樓2014-03-28 14:00:54

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6樓2014-03-28 14:49:02

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woolley

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6樓: Originally posted by wanglixia815 at 2014-03-28 14:49:02
恩，加燃料根據(jù)平時(shí)的慣例加得，他們做的DNA跑膠都是1⃣️比一加的，看起來沒有問題，我今天試試...謝謝拉。那你說我的產(chǎn)物可以去測(cè)序嗎...

可以去測(cè)序，除了第三塊膠的第三道（有條帶的道，從左開始數(shù)）好像有些雜條帶，不過關(guān)系不大。

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7樓2014-03-28 16:43:20

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小二郎

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wanglixia815(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-30 22:32:22

你的marker呢？我前幾天也出現(xiàn)這種情況，marker都拖帶厲害，后來發(fā)現(xiàn)是染料是染料使用方法跟一般的不一樣，你可以好好看看染料使用說明

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8樓2014-03-29 21:10:38

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8樓: Originally posted by 小二郎 at 2014-03-29 21:10:38
你的marker呢？我前幾天也出現(xiàn)這種情況，marker都拖帶厲害，后來發(fā)現(xiàn)是染料是染料使用方法跟一般的不一樣，你可以好好看看染料使用說明

我定的marker今天剛到，染料？是gel red嗎？我做膠的時(shí)候，60ml TBE 1ul gel red,0.9克agarose....

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9樓2014-04-02 20:02:34

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9樓: Originally posted by wanglixia815 at 2014-04-02 20:02:34
我定的marker今天剛到，染料？是gel red嗎？我做膠的時(shí)候，60ml TBE 1ul gel red,0.9克agarose.......

你跑下marker試試，如果marker都跑不好，就是你膠或者燃料的問題了，還有你的目的基因大概多長(zhǎng)��？為什么選擇1.5%的膠濃度？

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10樓2014-04-03 09:50:06

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