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北極星※金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
PCR電泳圖求解 已有1人參與
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PCR后上樣2.5ul，前8個(gè)孔為mix 引物 模板 水 中間八個(gè)為easy taq buffer dNTP 水 引物 前16個(gè)為相同引物，產(chǎn)物大小為392bp,后8個(gè)為easy taq 引物不同 不知道是什么原因?qū)е翽不出東西,求大家指點(diǎn) 2013-5-6 10PRMER.JPG [ Last edited by gyesang on 2013-5-6 at 14:38 ] |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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北極星※: 金幣+1, ★有幫助, 給了很多方面建議 謝謝 2013-05-06 21:46:53
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你的電泳基本上沒(méi)有PCR產(chǎn)物的帶出現(xiàn)。 不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的可能原因如下： PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有(1)模板核酸的制備，(2)引物的質(zhì)量與特異性,(3)酶的質(zhì)量及活性 (4)PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 模板：(1)模板中含有雜蛋白質(zhì)，(2)模板中含有Taq酶抑制劑，(3)模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，(4)在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。(5)模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。商家提供的酶制劑可能含有甘油，可用透析或者超濾適當(dāng)去除甘油成分。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：(1)選定一個(gè)好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。(3)引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。(4)引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，GC堿基少于40%，引物之間形成二聚體等。（5）引物一般20-30個(gè)堿基，至少要有18個(gè)堿基。（6）引物3’末端最好是G或C。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。調(diào)節(jié)鎂離子的濃度， 可由1.0mmol/L起以0.05mmol/L為單位逐漸上升，最高不超過(guò)10.0mmol/L。 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul�；�100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗�？梢允褂檬灨綦x方式的熱啟動(dòng)PCR。 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 |
3樓2013-05-06 17:23:47
chiden
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北極星※: 金幣+1, ★★★很有幫助, 從實(shí)際出發(fā) 很感謝 2013-05-06 21:46:10
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北極星※: 金幣+1, ★★★很有幫助, 從實(shí)際出發(fā) 很感謝 2013-05-06 21:46:10
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初看樓主的這個(gè)帖子內(nèi)容介紹，額，有點(diǎn)沒(méi)懂起樓主的描述意思是啥子 直接看圖，貌似樓主的MARKER應(yīng)該是2K plus，但是似乎沒(méi)跑開(kāi)，看起來(lái)很多條帶的樣子。 這就有點(diǎn)奇怪了哈，不曉得樓主是用的多少濃度的膠跑的。 在我們實(shí)驗(yàn)室跑膠跑了這樣的距離看不出來(lái)?xiàng)l帶有時(shí)候是正�，F(xiàn)象 原因： 1.在跑膠的過(guò)程中樣品會(huì)存在一定程度的彌散，而且樓主點(diǎn)樣的樣品量也比較小，這樣的距離成像無(wú)帶個(gè)人覺(jué)得實(shí)屬正常。 2.根據(jù)樓主MARKER條帶的位置來(lái)看，這個(gè)電泳的時(shí)間應(yīng)該比較長(zhǎng)，時(shí)間長(zhǎng)樣品也是會(huì)彌散的。 3.PCR未擴(kuò)增成功，本來(lái)嘛，PCR這個(gè)東西有時(shí)候就是個(gè)運(yùn)氣的問(wèn)題。 解決辦法： 1.重新PCR擴(kuò)增，多做幾次總會(huì)有一次成功的。 2.進(jìn)行梯度PCR，尋找最佳退火溫度。個(gè)人覺(jué)得一出事情就覺(jué)得自己引物設(shè)計(jì)有問(wèn)題是不明智的，畢竟重新設(shè)計(jì)引物到合成拿到手上至少4天以后，時(shí)間上就耽擱了，且不一定就真的是引物問(wèn)題。 3.電泳檢測(cè)時(shí)建議使用2.5%膠濃度。不曉得你們的電泳儀器是個(gè)啥子樣子的，反正MARKER剛好跑開(kāi)的時(shí)候成像是最好的，這個(gè)你可以自己解決的，避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。 |
4樓2013-05-06 18:44:02
范兒
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2樓2013-05-06 16:46:16
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5樓2013-05-06 18:45:58
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6樓2013-05-06 21:38:24
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7樓2013-05-06 21:43:13
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8樓2013-05-06 21:44:43
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