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[交流] 【求助/交流】做過(guò)大引物全質(zhì)粒PCR的進(jìn)來(lái)看

最近在做大引物全質(zhì)粒PCR以構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)，參考的文獻(xiàn)是Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP)
作者：Kentaro Miyazaki。文章出自Directed Evolution Library Creation：methods and protocols （Methods in Molecular Biology, 2003, Volume 231, I, 23-28, DOI: 10.1385/1-59259-395-X:23 ），此外還有一篇文章Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid，作者：Miyazaki K, Takenouchi ，文章出自.Biotechniques. 2002 Nov;33(5):1033-4, 1036-8.

這里我是用易錯(cuò)PCR的產(chǎn)物做大引物，易錯(cuò)PCR回收電泳圖如1所示，用的是2000的marker，易錯(cuò)PCR產(chǎn)物在1000bp左右，這個(gè)沒(méi)什么問(wèn)題，可是在大引物PCr結(jié)果如圖2所示，我的目標(biāo)質(zhì)粒是7K，兩邊為marker，一個(gè)5000，一個(gè)10000，中間兩個(gè)是結(jié)果，求解，為什么加樣孔處一片亮而沒(méi)有我的目的帶，照道理即便條件沒(méi)有優(yōu)化至少也該有目的為7K的帶吧。凝膠凝固后放的時(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)了，跑的結(jié)果不好。
我大引物PCr用的是Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,濃度：2.5U/uL，pcr的反應(yīng)體系總計(jì)50uL：其中大引物約0.5ug，模版DNA50ng，0.2mM的dNTP，PrimeSTAR HS DNA Polymerase用0.5ul，也就是1.25U，我的目標(biāo)質(zhì)粒是7K，PCR反應(yīng)程序：98 ℃，1min——98℃，10s——55℃，5s——72℃，7min——72℃，7min——4℃保存（基本按酶的使用說(shuō)明書進(jìn)行）。反應(yīng)共20個(gè)循環(huán)，求高人解答為什么會(huì)變成這個(gè)樣子。
圖1-易錯(cuò)PCR產(chǎn)物回收

圖2-大引物PCR結(jié)果

[ Last edited by wgl365 on 2010-8-31 at 20:44 ]

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1樓 2010-08-31 20:38:18

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12樓: Originally posted by tete1987 at 2013-12-26 13:04:40
點(diǎn)飽和突變，用的是小引物，很好P的。
大引物易錯(cuò)PCR，這個(gè)用的是長(zhǎng)片段當(dāng)引物，不太好P。但是按照文獻(xiàn)的方法能夠擴(kuò)增出來(lái)。我已經(jīng)轉(zhuǎn)化了，能長(zhǎng)很多，比酶切連接的效率高多了。...

飽和突變還好，呵呵

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16樓2014-01-02 22:36:10

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18樓: Originally posted by tete1987 at 2014-01-03 10:37:16
點(diǎn)錯(cuò)了，不小心贊了。。
是飽和突變，跟單點(diǎn)突變也沒(méi)什么差別吧，就是工作量大了點(diǎn)...

徐巖老師那里嗎？還是陳堅(jiān)校長(zhǎng)？

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20樓2014-01-04 11:22:13

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不懂哦

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2樓2010-08-31 20:40:21

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wgl365(金幣+1):感謝頂帖 2010-08-31 21:04:23

我覺(jué)得沒(méi)跑開(kāi) 你的PCR還是成功的 7K很大了不知道你的膠的濃度時(shí)多少

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ANNA&KEVIN

3樓2010-08-31 20:52:55

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Originally posted by xiangshengyan at 2010-08-31 20:52:55:
我覺(jué)得沒(méi)跑開(kāi) 你的PCR還是成功的 7K很大了不知道你的膠的濃度時(shí)多少

1%的瓊脂糖凝膠，不是7k太大的原因，10000的marker都能跑開(kāi)，平時(shí)我們跑畢赤酵母的pPIC9k也是這個(gè)濃度，都能跑開(kāi)

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4樓2010-08-31 21:03:56

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wgl365(金幣+5):呵呵，試試 2010-10-05 19:40:08

又是你啊。不知你實(shí)驗(yàn)怎么樣，剛看到你的求助。
我的建議：
1.不要用primerstar,用Pfu.
2酶量50微升體系要加1u的酶，因?yàn)镻的時(shí)間比較長(zhǎng)。
3程序按照文獻(xiàn)的程序

GOOD LUCK
別忘給我金幣

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5樓2010-10-04 21:43:10

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TMD，跟我的結(jié)果一模一樣

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6樓2012-09-25 21:08:11

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最近也在做大引物全質(zhì)粒PCR，遇到了類似的情況，請(qǐng)問(wèn)樓主當(dāng)時(shí)是怎么解決這個(gè)問(wèn)題的

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7樓2012-12-14 09:26:24

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跑了N遍大引物，同文啊

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8樓2013-05-07 16:45:08

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我現(xiàn)在也在做全質(zhì)粒PCR構(gòu)建文庫(kù)，用的跟你相同的條件。今天剛做完第二步PCR，點(diǎn)了8ul，能夠看見(jiàn)條帶。
我覺(jué)得這種方法應(yīng)該P(yáng)不出來(lái)很亮的質(zhì)粒條帶；
質(zhì)粒很大，電泳看大小不準(zhǔn)確；
所以樓主可以多點(diǎn)寫樣品看一下，能看到一點(diǎn)條帶就可以做轉(zhuǎn)化；
具體結(jié)果要以轉(zhuǎn)化出來(lái)為準(zhǔn)。
今天晚上做轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化出來(lái)結(jié)果再告訴你。

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嘿嘿，just for you~

9樓2013-12-20 16:22:05

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9樓: Originally posted by tete1987 at 2013-12-20 16:22:05
我現(xiàn)在也在做全質(zhì)粒PCR構(gòu)建文庫(kù)，用的跟你相同的條件。今天剛做完第二步PCR，點(diǎn)了8ul，能夠看見(jiàn)條帶。
我覺(jué)得這種方法應(yīng)該P(yáng)不出來(lái)很亮的質(zhì)粒條帶；
質(zhì)粒很大，電泳看大小不準(zhǔn)確；
所以樓主可以多點(diǎn)寫樣品看一下， ...

呵呵，你做點(diǎn)飽和突變么？

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10樓2013-12-24 10:27:11

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