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[交流]
【求助/交流】做過大引物全質(zhì)粒PCR的進(jìn)來看
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最近在做大引物全質(zhì)粒PCR以構(gòu)建隨機(jī)突變文庫，參考的文獻(xiàn)是Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP) 作者：Kentaro Miyazaki。文章出自Directed Evolution Library Creation：methods and protocols （Methods in Molecular Biology, 2003, Volume 231, I, 23-28, DOI: 10.1385/1-59259-395-X:23 ） ，此外還有一篇文章Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid，作者：Miyazaki K, Takenouchi ，文章出自.Biotechniques. 2002 Nov;33(5):1033-4, 1036-8. 這里我是用易錯(cuò)PCR的產(chǎn)物做大引物，易錯(cuò)PCR回收電泳圖如1所示，用的是2000的marker，易錯(cuò)PCR產(chǎn)物在1000bp左右，這個(gè)沒什么問題，可是在大引物PCr結(jié)果如圖2所示，我的目標(biāo)質(zhì)粒是7K，兩邊為marker，一個(gè)5000，一個(gè)10000，中間兩個(gè)是結(jié)果，求解，為什么加樣孔處一片亮而沒有我的目的帶，照道理即便條件沒有優(yōu)化至少也該有目的為7K的帶吧。凝膠凝固后放的時(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)了，跑的結(jié)果不好。 我大引物PCr用的是Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,濃度：2.5U/uL，pcr的反應(yīng)體系總計(jì)50uL：其中大引物約0.5ug，模版DNA50ng，0.2mM的dNTP，PrimeSTAR HS DNA Polymerase用0.5ul，也就是1.25U，我的目標(biāo)質(zhì)粒是7K，PCR反應(yīng)程序：98 ℃，1min——98℃，10s——55℃，5s——72℃，7min——72℃，7min——4℃保存（基本按酶的使用說明書進(jìn)行）。反應(yīng)共20個(gè)循環(huán)，求高人解答為什么會(huì)變成這個(gè)樣子。 圖1-易錯(cuò)PCR產(chǎn)物回收  圖2-大引物PCR結(jié)果  [ Last edited by wgl365 on 2010-8-31 at 20:44 ] |
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xiangshengyan
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