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[求助] 細(xì)菌引物 338F 518R 做DGGE之后 pcr 已有1人參與

DGGE 之后 pcr 出來的有兩條帶還不清晰怎么回事呀請(qǐng)大俠幫分析一下

12

[ Last edited by @@xiaowu@@ on 2011-12-29 at 20:03 ]

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1樓 2011-12-29 20:00:04

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zhang8826857(金幣+5): 鼓勵(lì)新蟲，加油 2011-12-30 10:53:48

PCR兩條帶差的較大，感覺是PCR的問題，理論上說你DGGE上樣樣品是大小類似的DNA，問題說明有些太簡(jiǎn)單，不好分析原因，詳細(xì)說說實(shí)驗(yàn)方法步驟，可能有助于解決你的問題。

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2樓2011-12-29 21:47:24

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樓: Originally posted by liuyj863 at 2011-12-29 21:47:24:
PCR兩條帶差的較大，感覺是PCR的問題，理論上說你DGGE上樣樣品是大小類似的DNA，問題說明有些太簡(jiǎn)單，不好分析原因，詳細(xì)說說實(shí)驗(yàn)方法步驟，可能有助于解決你的問題。

帶GC 的pcr產(chǎn)物挺亮的 DGGE跑完也很好
然后是pcr

10倍buffer 2.5
dntp 2.5
F與R 1
酶 0.25
模板 5
94 1min
60 1min
72 1min
35循環(huán)

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3樓2011-12-30 09:48:02

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rainwander(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2012-01-01 17:35:30

DGGE條帶割下來后，是怎么制備PCR模板的，時(shí)間放置有多長(zhǎng)，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，DGGE條帶割出來后放置時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增得不到產(chǎn)物，涂抹帶之類的情況。另外，擴(kuò)增引物也是帶了GC夾?是為了再跑一次DGGE，還是... （我以前割單條DGGE帶后無菌水沖洗，置于30ul無菌水中，無菌槍頭搗碎，置于4°C 過夜，第二天取1ul液體擴(kuò)增，效果很好�，F(xiàn)在很多年沒做過了，詳細(xì)情況也有些忘記了）

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4樓2011-12-30 11:27:39

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uneei

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zhang8826857(金幣+3): 鼓勵(lì)新蟲 2011-12-30 21:18:36

引用回帖:

4樓: Originally posted by liuyj863 at 2011-12-30 11:27:39:
DGGE條帶割下來后，是怎么制備PCR模板的，時(shí)間放置有多長(zhǎng)，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，DGGE條帶割出來后放置時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增得不到產(chǎn)物，涂抹帶之類的情況。另外，擴(kuò)增引物也是帶了GC夾?是為了再跑一次DGGE，還是... （我 ...

你好，我今天剛剛才做了PCR，昨天切膠，用無菌水洗了兩次，加入50微升的無菌水，無菌槍頭搗碎，4℃過夜，今天吸取10微升做模板，做60微升體系的PCR，十幾個(gè)樣只有一個(gè)擴(kuò)增效果還可以，其他的不是都二聚體就是只有一點(diǎn)點(diǎn)很淡的條帶，這是為什么�。课业腄GGE做的是銀染。

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5樓2011-12-30 20:20:40

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rainwander(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-01 17:35:47

以前我們一直用這樣的方法做，也是銀染，只不過用341F-518R擴(kuò)增，你換個(gè)擴(kuò)增程序試試，特別是退火溫度，是否可以降點(diǎn)，或者采用降落PCR策略。

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6樓2012-01-01 12:39:39

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5樓: Originally posted by uneei at 2011-12-30 20:20:40
你好，我今天剛剛才做了PCR，昨天切膠，用無菌水洗了兩次，加入50微升的無菌水，無菌槍頭搗碎，4℃過夜，今天吸取10微升做模板，做60微升體系的PCR，十幾個(gè)樣只有一個(gè)擴(kuò)增效果還可以，其他的不是都二聚體就是只有一 ...

你好，老師我現(xiàn)在也遇到了你相同的問題，請(qǐng)問你解決了嗎？究竟是什么原因呀？

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7樓2015-04-24 19:57:53

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7樓: Originally posted by 白蜓er at 2015-04-24 19:57:53
你好，老師我現(xiàn)在也遇到了你相同的問題，請(qǐng)問你解決了嗎？究竟是什么原因呀？...

嘿嘿直接做二代測(cè)序好了嘿嘿

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8樓2015-04-24 23:36:14

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8樓: Originally posted by 南大微生物 at 2015-04-24 23:36:14
嘿嘿直接做二代測(cè)序好了嘿嘿

...

那如果我需要DGGE之后TA克隆測(cè)序的話，這個(gè)怎么搞嘞，請(qǐng)問你有沒找到什么原因PCR擴(kuò)增不出來呀？

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9樓2015-04-25 11:20:56

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9樓: Originally posted by 白蜓er at 2015-04-25 11:20:56
那如果我需要DGGE之后TA克隆測(cè)序的話，這個(gè)怎么搞嘞，請(qǐng)問你有沒找到什么原因PCR擴(kuò)增不出來呀？...

引物的問題？

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10樓2015-06-12 13:13:14

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