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[交流]
【求助/交流】DNA提取方法（用于PCR-DGGE）
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我是環(huán)境專業(yè)的，課題做到這里導(dǎo)師要我用PCR-DGGE生物技術(shù)來(lái)做菌群分析。 我的反應(yīng)器是陶粒反應(yīng)器，具體的就是在陶粒上負(fù)載吸附了能處理特定污染物的菌體,導(dǎo)師讓我每個(gè)實(shí)驗(yàn)階段都取樣去做優(yōu)勢(shì)菌群分析。 請(qǐng)問(wèn)各位大蝦我這個(gè)情況，要提取菌的DNA要用怎樣的方法？還有陶粒上的微生物怎樣才能全部洗脫下來(lái)做菌群分析？ 在生物方面我只知道皮毛，勞請(qǐng)各位生物方面做過(guò)這方面研究的同仁們了！ |
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glidingwater
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翱宇(金幣+1): 鼓勵(lì)新蟲(chóng) 2011-02-24 19:46:13
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vanewan(金幣+10): 2011-02-26 18:11:40
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vanewan(金幣+10): 2011-02-26 18:11:40
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使用試劑盒提取總DNA,然后進(jìn)行PCR，就是做個(gè)16s rRNA基因高可變片段的擴(kuò)增，每種菌雖具有相同長(zhǎng)度但具有堿基不同組合的片段，然后進(jìn)行DGGE，得到條帶的多樣性，就是菌群的多樣性了。 條帶粗細(xì)的變化反應(yīng)著優(yōu)勢(shì)菌群的變化 [ Last edited by glidingwater on 2011-2-24 at 19:09 ] |
2樓2011-02-24 18:46:41
3樓2011-02-25 10:05:45
glidingwater
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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4樓2011-02-25 22:14:42
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rainwander(金幣+3): 鼓勵(lì)積極參與交流~~~ 2011-02-27 16:40:59
vanewan(金幣+2): 2011-02-27 16:52:06
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vanewan(金幣+2): 2011-02-27 16:52:06
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DGGE就是聚丙烯酰胺凝膠電泳的簡(jiǎn)稱嘛。我沒(méi)有聽(tīng)說(shuō)過(guò)還有“變性瓊脂糖凝膠”這個(gè)種DGGE膠。。  DGGE方法有其限制，所使用的PCR產(chǎn)物，帶GC夾，長(zhǎng)度只有小于500bp的PCR產(chǎn)物才能得到最后的分離。所以這么短的PCR產(chǎn)物所包含的序列信息是有限的。很多不同條帶測(cè)序后的結(jié)果竟然是同一物種。。  如果你做細(xì)菌的話，可以用下比較長(zhǎng)的引物做DGGE，比如引物341F和907R，這個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物較長(zhǎng)，但有時(shí)DGGE不怎么好看，因?yàn)镻CR產(chǎn)物分離的不徹底，太長(zhǎng)了。 如果想得到很好看的細(xì)菌圖譜，就用338F和518R吧，這個(gè)只有180bp的PCR片段在DGGE的時(shí)候會(huì)得到最徹底的分離。 |
7樓2011-02-27 13:43:45
rainwander
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8樓2011-02-27 16:42:05
9樓2011-02-27 17:01:51
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小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+2): 再次鼓勵(lì) 2011-02-27 21:19:24
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lstt09nk(金幣+2): 再次鼓勵(lì) 2011-02-27 21:19:24
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我常用蛋白酶K-CTAB法提取環(huán)境樣品中的DNA，超聲波破碎法實(shí)驗(yàn)室的前輩有人嘗試過(guò)，據(jù)說(shuō)效果也就那樣，可能跟樣品特性有關(guān)。 我覺(jué)得如果你超聲時(shí)間和強(qiáng)度把握好的話，對(duì)DNA片度是沒(méi)有多大影響的。 你可以用超聲波法將載體上的細(xì)胞洗脫下來(lái)，然后離心（大概5000-6000g，10min），然后采取相應(yīng)方法提取DNA。我年前幫人這么做過(guò)，效果非常不錯(cuò)。 |
10樓2011-02-27 21:15:44
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12樓2011-03-01 11:07:59
13樓2011-03-01 11:25:51
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15樓2011-03-01 12:28:19
16樓2011-03-01 15:36:54
17樓2012-12-10 08:51:43
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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GC是夾子 2007年的文獻(xiàn)“A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria”文獻(xiàn)中V1-V9的分區(qū)如下： The nine hypervariable regions spanned nucleotides 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986-1043, 1117-1173, 1243-1294 F是上游引物 |
18樓2013-01-08 14:15:16
zuihouyizhan
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