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wenmingfu木蟲 (著名寫手)
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[交流]
【求助/交流】求動物組織DNA提取方法 已有3人參與
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| 求動物組織DNA提取方法 |
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wenmingfu(金幣+2): 2010-11-03 15:20:51
wenmingfu(金幣+5): 2011-03-24 21:58:20
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Lysis Buffer 1. 100 mM Tris---HCL PH8.3 (50 ml 1M Tris) 2. 500 mM KCL (18.73 g ) 3. 0.1% Gelatin (0.5 g ) 4. 0.45% NP40 (2.25 ml ) 5. 0.45% Tween---20 (2.25 ml ) + H2O =500ml 用的時候加入PK 水浴55度過夜。第二天100度滅活，冷卻至4度后可以直接進行PCR鑒定 |
2樓2010-11-02 15:20:56
fzfangtao
木蟲 (正式寫手)
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dhd997(金幣+3):謝謝交流。 2010-11-02 19:13:50
wenmingfu(金幣+3): 2010-11-03 15:21:24
wenmingfu(金幣+3): 2011-03-24 21:57:55
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1. 組織樣品和培養(yǎng)細胞的裂解 （1）組織樣品 ① 將lg新鮮切取的組織在液氮中速凍，并用液氮預(yù)冷的研缽研磨。 ② 液氮揮發(fā)，將組織粉末一點一點地加入盛有10倍體積裂解液的燒杯中，使其分散于裂解液表面，后振搖燒杯使粉末浸沒。 ③ 將懸液轉(zhuǎn)移至50ml三角瓶中，并于37℃溫育1h，立即進行步驟1.2.。 （2）培養(yǎng)細胞 ①單層培養(yǎng)細胞 i.從孵箱中取出長滿單層細胞的培養(yǎng)皿，迅速吸去培養(yǎng)液，用冰冷的TBS洗2次，加入1ml新鮮的冰冷的TBS。 ii. 用橡膠刮棒將細胞刮入1ml TBS中，用吸管將細胞懸液轉(zhuǎn)移到冰上的離心管中。用0.5 ml冰冷的TBS沖洗培養(yǎng)皿，后并入離心管的細胞懸液。 iii.于4℃3000r/min離心10min以收集細胞。 iv. 將細胞重懸于5倍~10倍體積的冰冷TBS中并再度離心。 v. 用1 ml TE（PH8.0）重新懸浮細胞，轉(zhuǎn)移至50 ml三角瓶中。 vi. 每毫升細胞懸液加10 ml裂解緩沖液，于37℃溫育1h，立即進行步驟1.2.。 ②懸浮培養(yǎng)的細胞 i.將細胞轉(zhuǎn)移至離心管，于4℃3000r/min離心10min以收集細胞，吸去上清。 ii.用1倍體積冰冷的TBS重懸細胞并再度離心，吸去上清，小心地再次重懸細胞于冰冷的TBS中，離心收集細胞。 iii.去上清，用1ml TE（PH8.0）重新懸浮細胞，轉(zhuǎn)移至50 ml三角瓶中。 iv.每毫升細胞懸液加10 ml裂解緩沖液，于37℃溫育1h，立即進行步驟1.2.。 2.將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，裂解液不能超過1/3體積。 3.加入蛋白酶K（20mg/ml）至終濃度100µg/ml。用一滅菌玻璃棒溫和地將酶混入細胞裂解液中。 4.將細胞裂解液置于50℃水浴中保溫3 h，并不時振搖。 5.將溶液冷卻至室溫，加入等體積的平衡酚，將離心管置于渦旋器上,使離心管緩慢顛轉(zhuǎn)10min 以溫和地混合兩相。 6.室溫下，6500r/min離心15 min以分離兩相。 7.用寬口移液管將黏滯的水相轉(zhuǎn)移至另一離心管。 8.苯酚抽提兩次，收集水相。 9.加入0.2倍體積10mol/L醋酸銨及2倍體積無水乙醇，旋轉(zhuǎn)離心管直至溶液徹底混勻為止。 10.DNA隨即形成沉淀，在室溫下6500r/min離心5 min，收集沉淀。 11.用70%乙醇洗滌DNA沉淀2次，按步驟1.10.離心收集DNA。 12.盡可能吸去殘余乙醇,于室溫下，將DNA沉淀置于敞開的管內(nèi)，直至乙醇揮發(fā)殆盡。 13.按每0.1m1細胞(步驟1.1)加入1ml TE溶解DNA，將DNA溶液儲存于4℃。 14.用紫外分光光度法或二苯胺顯色法檢測DNA含量。詳見本實驗第二部分。 |
3樓2010-11-02 17:20:28
zhanglin_84
木蟲 (正式寫手)
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7樓2013-01-09 10:52:32
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
xy656691: 金幣+2, 應(yīng)助指數(shù)+1 2013-01-11 21:45:24
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
xy656691: 金幣+2, 應(yīng)助指數(shù)+1 2013-01-11 21:45:24
| 看你做的是什么類群的動物了。如果是保護動物的話只能取毛發(fā)、糞便、血液這些提取DNA，最好去買個試劑盒提吧，比如我們這里常用的Axygen的。如果是普通的動物，個體又比較大的話可以直接解剖取組織。我們這里用的是比較原始的酚氯仿方法，直接取樣用剪刀剪碎。一般都用自己配制的裂解緩沖液，具體的配方你可以參考《分子克隆指南》。取一個火柴頭大小的新鮮樣品（如果是酒精保存的樣品，需要先用雙蒸水脫醇）置于裂解緩沖液中，用干凈的剪刀剪碎，一直剪到看不到明顯的大顆粒，有條件的話也可以用電動勻漿器粉碎。組織懸浮液中加入蛋白酶K，于55℃水浴中消化6-8小時。如果不好消化的時候也可以消化過夜。但最好不要超過16個小時。之后的操作就是經(jīng)典的酚氯仿抽提方法了。第一次加入與消化液等體積的飽和酚，上下顛倒混勻15min，8000rpm離心10min，取上清；第二次向上清中加入1/2體積飽和酚，1/2體積氯仿-異戊醇（貌似比例是13:2，試劑公司有配好的賣），上下顛倒混勻15min，8000rpm離心10min，取上清；要注意不要將上清液和下面的有機溶劑中間分界線上的白色蛋白質(zhì)吸上來。如果覺得吸上來了可以重復(fù)第二步；第三次向上清中加入等體積氯仿-異戊醇，上下顛倒混勻15min，8000rpm離心10min，取上清。然后向上清液中加入2倍體積無水乙醇或等體積異丙醇沉淀DNA，這步要加NaAc的，具體的量可以看《分子克隆指南》。上下顛倒混勻后加無水乙醇的可以放4℃1小時或是-20℃ ≥8h充分沉淀。異丙醇可以在室溫靜置1h。之后12000rpm離心，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀后，置于室溫風(fēng)干。最后用雙蒸水溶解就可以了。 |
8樓2013-01-11 11:43:35
9樓2013-01-21 20:49:41
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