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憶-雪銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
急求RT-PCR電泳圖分析 已有1人參與
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急求各位高手忙我分析分析這是什么原因，第一張和第3張圖右邊的條帶呈涂抹狀，這是為什么？ 圖1：退火溫度55度，為什么與marker相鄰的兩孔目的條帶上下有條帶，而另外兩空卻沒(méi)有？（前兩空和后兩空模板合成時(shí)間不一樣，后兩孔模板合成快1周了，前兩空是今天合成的。） 圖2：退火溫度58度，為什么后面幾個(gè)條帶呈涂抹狀，是因?yàn)橥嘶饻囟忍吡藛�？�(jī)?nèi)參條帶很亮，內(nèi)參條帶旁邊的兩空的條帶跟我參考的文獻(xiàn)片段長(zhǎng)短不一樣，文獻(xiàn)報(bào)道是266bp,而我擴(kuò)增出來(lái)的是300多bp，我合成的引物跟文獻(xiàn)完全一致，這是為什么，難道這不是我的目的基因嗎？我重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果都一樣。 圖3：退火溫度48度，結(jié)果同圖2后面條帶一致，呈涂抹狀，我試過(guò)50度，55度，結(jié)果都是涂抹狀，這是為什么? 擴(kuò)增體系是20ul,其中引物1ul,cDNA2ul PCR條件：94度，5min;94度 30s;退火溫度上述溫度；72度45s，循環(huán)30次，72度 7min. 現(xiàn)在很是惆悵，希望各位高手幫我這菜鳥(niǎo)分析分析！ 內(nèi)參圖，退火溫度55度 內(nèi)參和樣品圖 48度樣品圖 |
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憶-雪
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15樓2012-04-02 09:16:32
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嗯 個(gè)人看法： 1. 這種涂抹，也就是Smear，簡(jiǎn)稱彌散帶，在條帶上還是條帶下Smear都是有講究的，一般單單是上部Smear普遍是Template過(guò)量，上下都Smear就問(wèn)題多了，退火時(shí)間長(zhǎng)、退火溫度低等等太多了，建議找TaKaRa官方網(wǎng)站去看問(wèn)題集解，會(huì)有詳細(xì)說(shuō)明。單單條帶下Smear，我還沒(méi)有見(jiàn)過(guò)........ 2. 圖二，有特異產(chǎn)物范圍內(nèi)的Smear，恰恰與你說(shuō)法相反，退火溫度可能過(guò)低了，需要5度5度往上調(diào)做大范圍嘗試，再2度微調(diào)，還有你認(rèn)為條帶范圍不符，那很正常，我覺(jué)得在測(cè)序前一切都不好說(shuō)，因?yàn)槊窧uffer引起條帶滯后性，因?yàn)槟z沒(méi)混勻引起滯后性偶都見(jiàn)過(guò)，還有一次，我對(duì)比Marker發(fā)現(xiàn)我克隆的Gene高了數(shù)百bp，最后去測(cè)序，其實(shí)是正確滴。 3. 圖三，有根據(jù)你的引物來(lái)優(yōu)化你的Tm嗎？看你從48試到55......變化范圍蠻大.....其實(shí)我感覺(jué)若你圖三的擴(kuò)增子長(zhǎng)也是300左右bp的話，結(jié)合你變性溫度和時(shí)間，應(yīng)該用的是普通Taq，45s的延伸未免就太長(zhǎng)了，45s的話Taq都能延1kb了，所以時(shí)間也需要優(yōu)化。 希望能有所幫助  若有說(shuō)錯(cuò)，請(qǐng)高手指正 |
2樓2012-03-29 00:36:38
atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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模板的量我覺(jué)得有點(diǎn)大，我跑100ul的體系的時(shí)候一共加2ulcDNA 另外，你說(shuō)的你的引物是文獻(xiàn)的，你做了BLAST了么 有時(shí)候文獻(xiàn)的引物會(huì)寫(xiě)錯(cuò)一兩個(gè)堿基。。。自己仔細(xì)比對(duì)下 另外，做之前，要做個(gè)內(nèi)參，看看你模板的質(zhì)量。。。 祝好運(yùn) |
10樓2012-03-30 19:34:49
孫啟亮
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西瓜
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