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求索尋覓金蟲 (小有名氣)
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大家?guī)兔Ψ治鱿码p向電泳結(jié)果不好的原因（有圖）
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裂解液配方是：7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，0.3% Bio-lyte，65 mM DTT，加入了羅氏蛋白酶抑制劑。大鼠肝臟在液氮中研磨，大約0.1 g肝臟加入了1ML裂解液，然后冰浴超聲了1分鐘（就是放進去超聲零點幾秒然后拿出1秒，再放進去，搞了1分鐘）。冰上裂解1h后，35000 g離心 90 min（這個轉(zhuǎn)速已經(jīng)是我們實驗的極限了）。吸取上清做后續(xù)實驗。 測定了蛋白濃度大概為20mg/ml，水化時吸取了100ul 加入400ul 水化緩沖液（水化緩沖液配方和裂解液一致），上樣450ul進行水化，我做的是24cm的膠條，ph 3-10。我做了三根膠條，2根在水化緩沖液家了DTT，第三根加了 TBP（據(jù)說TBP可以很好的解決堿性端橫紋的問題）。水化了大概14h，然后進行等點聚焦。程序如下 100v 緩慢 1h 200v 緩慢 1h 500v 緩慢 1h 1000v 緩慢 1h 10000v 線性 4h 10000v 快速 100000v.H 500 v 快速 24h 聚焦后用的gel膠為10%的，先用50v，再用200v跑完。 結(jié)果如下圖，分別為1，2，3，左邊是正極端。請大家?guī)兔Ψ治鱿略�，不甚感激�?br /> ps：我已經(jīng)做了幾個月了，結(jié)果總這樣差不多爛，別人論文里面也是這樣，但是圖譜上蛋白點多很多，也分散的均勻，實在想不明白。 |
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