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求索尋覓金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
大家?guī)兔Ψ治鱿码p向電泳結(jié)果不好的原因（有圖）
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裂解液配方是：7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，0.3% Bio-lyte，65 mM DTT，加入了羅氏蛋白酶抑制劑。大鼠肝臟在液氮中研磨，大約0.1 g肝臟加入了1ML裂解液，然后冰浴超聲了1分鐘（就是放進(jìn)去超聲零點(diǎn)幾秒然后拿出1秒，再放進(jìn)去，搞了1分鐘）。冰上裂解1h后，35000 g離心 90 min（這個(gè)轉(zhuǎn)速已經(jīng)是我們實(shí)驗(yàn)的極限了）。吸取上清做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 測(cè)定了蛋白濃度大概為20mg/ml，水化時(shí)吸取了100ul 加入400ul 水化緩沖液（水化緩沖液配方和裂解液一致），上樣450ul進(jìn)行水化，我做的是24cm的膠條，ph 3-10。我做了三根膠條，2根在水化緩沖液家了DTT，第三根加了 TBP（據(jù)說(shuō)TBP可以很好的解決堿性端橫紋的問(wèn)題）。水化了大概14h，然后進(jìn)行等點(diǎn)聚焦。程序如下 100v 緩慢 1h 200v 緩慢 1h 500v 緩慢 1h 1000v 緩慢 1h 10000v 線性 4h 10000v 快速 100000v.H 500 v 快速 24h 聚焦后用的gel膠為10%的，先用50v，再用200v跑完。 結(jié)果如下圖，分別為1，2，3，左邊是正極端。請(qǐng)大家?guī)兔Ψ治鱿略颍簧醺屑ぁ?br /> ps：我已經(jīng)做了幾個(gè)月了，結(jié)果總這樣差不多爛，別人論文里面也是這樣，但是圖譜上蛋白點(diǎn)多很多，也分散的均勻，實(shí)在想不明白。 |
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 電泳、bio-rad 電轉(zhuǎn)化儀及操作 |
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Rubisco580
金蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
求索尋覓(金幣+1): ★有幫助 我的IPG Buffer的配方和裂解液大致相同，就是我說(shuō)的水化上樣緩沖液，只是兩性載體濃度有差別。您能不能具體給我說(shuō)下，謝謝啊。 2011-12-30 22:32:29
求索尋覓(金幣+1): ★有幫助 我的IPG Buffer的配方和裂解液大致相同，就是我說(shuō)的水化上樣緩沖液，只是兩性載體濃度有差別。您能不能具體給我說(shuō)下，謝謝啊。 2011-12-30 22:32:29
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1.裂解液水化液不加 IPGBuffer？ 2.上樣量怎么那么大？我做的時(shí)候上200~300 ug，聚焦50000Vhrs。只有質(zhì)譜的時(shí)候才上這么大量聚焦100000 Vhrs。 3.膠條行不行？有時(shí)候差的膠條聚焦是會(huì)不好的。 希望有幫助 |
4樓2011-12-22 16:35:41
zjkown
木蟲(chóng) (初入文壇)
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2樓2011-12-22 06:44:19
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
求索尋覓(金幣+1): 謝謝建議。我加了羅氏的蛋白酶抑制劑，是那種片劑，能抑制多種蛋白酶的。因?yàn)榧恿说鞍酌敢种苿�，我想�?yīng)該加入核酸酶也沒(méi)效果了，會(huì)被抑制，你說(shuō)是嗎？ 2011-12-30 22:29:50
求索尋覓(金幣+1): 謝謝建議。我加了羅氏的蛋白酶抑制劑，是那種片劑，能抑制多種蛋白酶的。因?yàn)榧恿说鞍酌敢种苿�，我想�?yīng)該加入核酸酶也沒(méi)效果了，會(huì)被抑制，你說(shuō)是嗎？ 2011-12-30 22:29:50
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1你為什么不加蛋白酶抑制劑比如PMSF，EDTA，這可能是你蛋白損失的重要原因之一，要不就是你離心太久了，我都是20000g30min的 2 DTT有點(diǎn)多吧 3 為什么不加點(diǎn)核酸酶 4你的膠為蝦米都不加marker的 |
3樓2011-12-22 10:03:59
求索尋覓
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5樓2011-12-30 22:27:46
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