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憶-雪銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
急求RT-PCR電泳圖分析 已有1人參與
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急求各位高手忙我分析分析這是什么原因，第一張和第3張圖右邊的條帶呈涂抹狀，這是為什么？ 圖1：退火溫度55度，為什么與marker相鄰的兩孔目的條帶上下有條帶，而另外兩空卻沒有？（前兩空和后兩空模板合成時間不一樣，后兩孔模板合成快1周了，前兩空是今天合成的。） 圖2：退火溫度58度，為什么后面幾個條帶呈涂抹狀，是因為退火溫度太高了嗎？內(nèi)參條帶很亮，內(nèi)參條帶旁邊的兩空的條帶跟我參考的文獻片段長短不一樣，文獻報道是266bp,而我擴增出來的是300多bp，我合成的引物跟文獻完全一致，這是為什么，難道這不是我的目的基因嗎？我重復試驗3次，結(jié)果都一樣。 圖3：退火溫度48度，結(jié)果同圖2后面條帶一致，呈涂抹狀，我試過50度，55度，結(jié)果都是涂抹狀，這是為什么? 擴增體系是20ul,其中引物1ul,cDNA2ul PCR條件：94度，5min;94度 30s;退火溫度上述溫度；72度45s，循環(huán)30次，72度 7min. 現(xiàn)在很是惆悵，希望各位高手幫我這菜鳥分析分析！ 內(nèi)參圖，退火溫度55度 內(nèi)參和樣品圖 48度樣品圖 |
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嗯 個人看法： 1. 這種涂抹，也就是Smear，簡稱彌散帶，在條帶上還是條帶下Smear都是有講究的，一般單單是上部Smear普遍是Template過量，上下都Smear就問題多了，退火時間長、退火溫度低等等太多了，建議找TaKaRa官方網(wǎng)站去看問題集解，會有詳細說明。單單條帶下Smear，我還沒有見過........ 2. 圖二，有特異產(chǎn)物范圍內(nèi)的Smear，恰恰與你說法相反，退火溫度可能過低了，需要5度5度往上調(diào)做大范圍嘗試，再2度微調(diào)，還有你認為條帶范圍不符，那很正常，我覺得在測序前一切都不好說，因為酶Buffer引起條帶滯后性，因為膠沒混勻引起滯后性偶都見過，還有一次，我對比Marker發(fā)現(xiàn)我克隆的Gene高了數(shù)百bp，最后去測序，其實是正確滴。 3. 圖三，有根據(jù)你的引物來優(yōu)化你的Tm嗎？看你從48試到55......變化范圍蠻大.....其實我感覺若你圖三的擴增子長也是300左右bp的話，結(jié)合你變性溫度和時間，應(yīng)該用的是普通Taq，45s的延伸未免就太長了，45s的話Taq都能延1kb了，所以時間也需要優(yōu)化。 希望能有所幫助  若有說錯，請高手指正 |
2樓2012-03-29 00:36:38
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