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[求助]
求助-4Kb的基因P不出來(lái)
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有一個(gè)4Kb的基因，我需要把它P出來(lái)然后夠載體，用cDNA二鏈為模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都試過(guò)了，退火溫度也做過(guò)梯度，還有，分成兩段進(jìn)行拼接的方法也用過(guò)，都是P不出來(lái)。請(qǐng)各位大蝦指點(diǎn)一二，不甚感激��！ [ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ] |
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模板是什么？有沒(méi)有想辦法優(yōu)化模板質(zhì)量？ 現(xiàn)在的TAQ酶擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的能力有了很大提高，分段擴(kuò)增顯得沒(méi)有必要。如果你的內(nèi)參片段能擴(kuò)增出來(lái)，應(yīng)該嘗試直接擴(kuò)增4KB。分段擴(kuò)增連來(lái)連去很麻煩，是不得以的選擇。 |
5樓2012-10-18 11:39:56
hj890509
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采用的是重疊延伸PCR，有些片段是通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增，目的是為了增加重疊區(qū)域的長(zhǎng)度，例如， 擴(kuò)增GH片段， 第一輪擴(kuò)增所用條件和體系為 模板（cDNA擴(kuò)增后的片段） 1ul GHu1 1ul GHd1 1ul 10*buffer 5ul dNTP 4ul Taq plus 0.5ul H2O 37.5ul GH片段PCR擴(kuò)增條件為: 94 ℃ 預(yù)變性 5min、94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸2min30s、72 ℃最后一輪 10min、進(jìn)行30 循環(huán) 。（GH片段大約為2.5kb) 第二輪擴(kuò)增條件和體系完全相同，除過(guò)模板用第一輪擴(kuò)增出來(lái)的為模板， 我們剛開始時(shí)候也擴(kuò)不出來(lái)經(jīng)過(guò)分析進(jìn)行調(diào)整模板濃度、比例以及PCR條件都摸索了好長(zhǎng)時(shí)間，之后經(jīng)過(guò)分析之后，問(wèn)題可能是：①DG片段的濃度過(guò)低，于是，重新擴(kuò)增DG片段，并用少量的TE回收，目的是為了提高DG的濃度。②PCR程序可能需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。于是，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)基因片段的濃度進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，并對(duì)PCR的程序進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)。即實(shí)驗(yàn)——反饋、改進(jìn)——再實(shí)驗(yàn)的過(guò)程。 |
6樓2012-10-18 12:03:32
7樓2012-10-18 12:22:01
植物園園長(zhǎng)
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8樓2012-10-18 16:15:57
植物園園長(zhǎng)
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9樓2012-10-18 16:18:25
10樓2012-10-18 16:57:35
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