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[交流]
【求助/交流】質(zhì)粒跟目的基因連接不上怎么辦
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pMD 19與長片段cDNA連接，16度1h（或4度過夜），年前能連接上，現(xiàn)在連不上了，有人在做相關實驗嗎？能回答一下嗎？ 有人建議連接時間延長，可信嗎？ |
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麥兜響當當(金幣+10): thank you very much!實驗條件和試劑材料都沒有問題，除了室溫年前年后這個可能不一樣，can you give another explaination? your rapid answer will be highly appreciated! 2011-03-11 20:36:39
lstt09nk(金幣+2): 鼓勵 2011-03-12 15:33:39
麥兜響當當(金幣+10): thank you very much!實驗條件和試劑材料都沒有問題，除了室溫年前年后這個可能不一樣，can you give another explaination? your rapid answer will be highly appreciated! 2011-03-11 20:36:39
lstt09nk(金幣+2): 鼓勵 2011-03-12 15:33:39
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年前可以，年后不行，可能的原因太多了: 1) 你是否已經(jīng)排除了所有試劑因素，包括連接酶，載體等等。比如其他人用這些酶或者載體成功過了嗎？ 2）你重復試驗了嗎？ 3）感受態(tài)細胞是否存在問題？ 這些都確定沒問題了，再考慮其他問題。 |
2樓2011-03-10 19:25:06
3樓2011-03-12 10:36:36
4樓2011-03-12 11:10:51
5樓2011-03-12 12:15:18
6樓2011-03-12 14:43:24
7樓2011-03-12 15:05:51
8樓2011-03-12 20:47:17
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11樓2011-03-12 23:01:11
12樓2011-03-12 23:55:33
13樓2011-03-13 11:22:02
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lstt09nk(金幣+4): 鼓勵交流，歡迎常來 2011-03-15 12:23:31
lstt09nk(金幣+4): 鼓勵交流，歡迎常來 2011-03-15 12:23:31
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連接T載體的構建要注意的幾點： 1.使用EXTAQ或TAQ擴增完CDNA后，片段末端是有A的，這個時候盡快膠回收，做上與 T載體的連接，至少不要把PCR產(chǎn)物或回收后產(chǎn)物放置2天以上，因為我們這里出現(xiàn)過可能末端A丟失的情況。 2.了解一下你的T載體使用情況，看看同實驗室其他人最近有成功構建過沒，如果沒有，你還要考慮下T載體降解問題。對于這個問題，我要補充的是，一般有人會從產(chǎn)品原裝吸取的T載體進行稀釋后使用，但是我們這里的經(jīng)驗是：稀釋后的T載體在以后的使用中，降解情況非常明顯，常做不出來，可能是保存問題。所以，你也可以從原裝T載體中吸取少量來做。 3其次，我把我們這里用的T載體連接的材料和方法說下，希望對你有幫助。 我們用的T載體是PMD-19 T，是takara的產(chǎn)品。我用的體系是參照說明書的，我是直接取用原裝T載體，效果一直還可以。 祝樓主早日解決問題！實驗順利！  |
14樓2011-03-14 21:33:46
15樓2011-03-15 15:40:31
16樓2011-03-15 16:08:51
17樓2012-02-10 13:47:11
18樓2015-03-11 10:08:00
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