麥兜響當(dāng)當(dāng)

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[交流] 【求助/交流】質(zhì)粒跟目的基因連接不上怎么辦

pMD 19與長(zhǎng)片段cDNA連接，16度1h（或4度過(guò)夜），年前能連接上，現(xiàn)在連不上了，有人在做相關(guān)實(shí)驗(yàn)嗎？能回答一下嗎？
有人建議連接時(shí)間延長(zhǎng)，可信嗎？

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1樓 2011-03-10 19:21:58

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zhengfan1109

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麥兜響當(dāng)當(dāng)(金幣+10): thank you very much!實(shí)驗(yàn)條件和試劑材料都沒(méi)有問(wèn)題，除了室溫年前年后這個(gè)可能不一樣，can you give another explaination? your rapid answer will be highly appreciated! 2011-03-11 20:36:39
lstt09nk(金幣+2): 鼓勵(lì) 2011-03-12 15:33:39

引用回帖:

Originally posted by 麥兜響當(dāng)當(dāng) at 2011-03-10 19:21:58:
pMD 19與長(zhǎng)片段cDNA連接，16度1h（或4度過(guò)夜），年前能連接上，現(xiàn)在連不上了，有人在做相關(guān)實(shí)驗(yàn)嗎？能回答一下嗎？
有人建議連接時(shí)間延長(zhǎng)，可信嗎？

年前可以，年后不行，可能的原因太多了:
1) 你是否已經(jīng)排除了所有試劑因素，包括連接酶，載體等等。比如其他人用這些酶或者載體成功過(guò)了嗎？
2）你重復(fù)試驗(yàn)了嗎？
3）感受態(tài)細(xì)胞是否存在問(wèn)題？

這些都確定沒(méi)問(wèn)題了，再考慮其他問(wèn)題。

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2樓2011-03-10 19:25:06

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sofili

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???

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3樓2011-03-12 10:36:36

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phoenix211

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多連會(huì)，我們一般都十六度過(guò)夜。
換一批感受態(tài)，可能就好了。

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4樓2011-03-12 11:10:51

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tw7921

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連的時(shí)間有點(diǎn)短，如果用的solution1還可以，用的T4要過(guò)夜。
另外最可能的就是感受態(tài)的效率過(guò)低

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5樓2011-03-12 12:15:18

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xiaoyu1014126

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有可能感受態(tài)時(shí)間長(zhǎng)效率太低！

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6樓2011-03-12 14:43:24

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woshishao

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lstt09nk(金幣+2): 感謝參與 2011-03-12 15:34:46
麥兜響當(dāng)當(dāng)(金幣+5): ExTaq，用的solution1,按說(shuō)明書是1小時(shí)，可是連接不上，能再幫忙分析一下嗎？ 2011-03-12 19:37:22

能問(wèn)問(wèn)你用的什么酶擴(kuò)增的cDNA？問(wèn)這個(gè)問(wèn)題的目的在于：看是否是PCR產(chǎn)物末端加A問(wèn)題。若沒(méi)有，就檢查一下你的體系。5U/ml和1U/ml的T4酶用16℃連接4小時(shí)以上，用產(chǎn)品自帶solution1就看說(shuō)明書了。

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7樓2011-03-12 15:05:51

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anika

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我覺(jué)得該看一下片段有沒(méi)有降解！最近我也碰到這個(gè)問(wèn)題！---個(gè)人建議

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8樓2011-03-12 20:47:17

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sai00fuji

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翱宇(金幣+1): 鼓勵(lì)交流！ 2011-03-13 15:40:46
麥兜響當(dāng)當(dāng)(金幣+5): 2011-03-15 09:09:25

長(zhǎng)片段我都是4度連接24h
片段放久了，末端的A會(huì)掉，你重新純化看看

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9樓2011-03-12 20:53:09

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yabing0324

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重新做吧，找原因太費(fèi)事費(fèi)勁

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10樓2011-03-12 21:48:05

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zhangxn2010

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粘性末端還是平末端?試試堿性磷酸酶處理載體吧

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11樓2011-03-12 23:01:11

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cauzhangtao

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pcr完了產(chǎn)物不要時(shí)間太長(zhǎng)
估計(jì)是載體壞了
呵呵
ta克隆
載體的那個(gè)T很容易丟失的

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12樓2011-03-12 23:55:33

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cxl_yll

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多長(zhǎng)算長(zhǎng)��？我10K的怎么辦啊？

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13樓2011-03-13 11:22:02

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woshishao

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lstt09nk(金幣+4): 鼓勵(lì)交流，歡迎常來(lái) 2011-03-15 12:23:31

連接T載體的構(gòu)建要注意的幾點(diǎn)：
1.使用EXTAQ或TAQ擴(kuò)增完CDNA后，片段末端是有A的，這個(gè)時(shí)候盡快膠回收，做上與 T載體的連接，至少不要把PCR產(chǎn)物或回收后產(chǎn)物放置2天以上，因?yàn)槲覀冞@里出現(xiàn)過(guò)可能末端A丟失的情況。
2.了解一下你的T載體使用情況，看看同實(shí)驗(yàn)室其他人最近有成功構(gòu)建過(guò)沒(méi)，如果沒(méi)有，你還要考慮下T載體降解問(wèn)題。對(duì)于這個(gè)問(wèn)題，我要補(bǔ)充的是，一般有人會(huì)從產(chǎn)品原裝吸取的T載體進(jìn)行稀釋后使用，但是我們這里的經(jīng)驗(yàn)是：稀釋后的T載體在以后的使用中，降解情況非常明顯，常做不出來(lái)，可能是保存問(wèn)題。所以，你也可以從原裝T載體中吸取少量來(lái)做。
3其次，我把我們這里用的T載體連接的材料和方法說(shuō)下，希望對(duì)你有幫助。
我們用的T載體是PMD-19 T，是takara的產(chǎn)品。我用的體系是參照說(shuō)明書的，我是直接取用原裝T載體，效果一直還可以。
祝樓主早日解決問(wèn)題！實(shí)驗(yàn)順利！