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[交流] pGEM-T Easy載體的相關(guān)問題-討論

大家出來討論一下吧：
細(xì)菌的某個(gè)基因發(fā)生改變，要看它對(duì)細(xì)菌其他基因表達(dá)水平的影響，就需要將未突變的這段基因連接到載體上，在將其轉(zhuǎn)入存在突變的菌體內(nèi)，對(duì)比轉(zhuǎn)化前后的不同，而得出結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)室沒有做過相關(guān)實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)各位說說該實(shí)驗(yàn)的難易？注意事項(xiàng)？關(guān)鍵環(huán)節(jié)？連接體系........
謝謝！

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1樓 2011-06-08 11:05:02

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zhouying_613

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1949stone(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-06-08 16:17:17
475502411(金幣+1): 2011-06-08 17:18:08

實(shí)驗(yàn)流程很容易，但是不知道和你的標(biāo)題T-vector有啥關(guān)系？
而且如果是我設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，我肯定是拿突變菌株和野生型做比較，看你要研究的那幾個(gè)基因的表達(dá)差異。你這是要做恢復(fù)突變，確認(rèn)表型的吧？

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2樓2011-06-08 12:15:18

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susizheng

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475502411(金幣+1): 2011-06-08 17:18:15

是啊，你標(biāo)題上的載體是做克隆用的，不是做表達(dá)用的哦。

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3樓2011-06-08 13:20:12

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天使托

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dhd997(金幣+5, EPI+1): 2011-06-08 14:44:24
475502411(金幣+5): 2011-06-08 16:29:59

這個(gè)比較容易做。。。
首先你要先將目的基因（就是你要檢測(cè)該基因是否在突變體中的表達(dá)發(fā)生變化了）和載體連接上，當(dāng)然這個(gè)是連接問題了，連接我覺得樓主應(yīng)該沒有什么問題吧？

其實(shí)驗(yàn)證連接好之后，將重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)突變體中，同時(shí)將該重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型菌中，然后對(duì)比兩個(gè)重組載體上的目的基因的表達(dá)是否發(fā)生變化，當(dāng)然了，這個(gè)后期檢測(cè)可以用發(fā)光，表達(dá)量等等來檢測(cè)。。。

其實(shí)還有另外一種方法可以達(dá)到樓主的需要，就是DNA microassay.你可以將你的突變體的mRNA提取出來，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后交由生物公司做一個(gè)基因芯片，這樣你就會(huì)知道你的突變體里面哪些基因的表達(dá)發(fā)生變化了，就方便你尋找整調(diào)節(jié)或者負(fù)調(diào)節(jié)的基因了。

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4樓2011-06-08 14:25:04

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Originally posted by 天使托 at 2011-06-08 14:25:04:
這個(gè)比較容易做。。。
首先你要先將目的基因（就是你要檢測(cè)該基因是否在突變體中的表達(dá)發(fā)生變化了）和載體連接上，當(dāng)然這個(gè)是連接問題了，連接我覺得樓主應(yīng)該沒有什么問題吧？

其實(shí)驗(yàn)證連接好之后，將重組載體 ...

謝謝您，我才開始設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，還沒有開始做，想跟大家取取經(jīng)，省的走太多的彎路。想問一下問題：
1.目的基因如果用的是Taq 聚合酶是不是就不用進(jìn)行加尾A反應(yīng)了？
2.連接是，連接時(shí)目的基因和載體的摩爾比是3:1-1:3，那目的DNA的魔都怎么確定呢？
3.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入臨床分離株（含突變位點(diǎn)）時(shí)，有哪些轉(zhuǎn)化方法？
謝謝您，初次做，望多指教�。�！

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5樓2011-06-08 16:29:34

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天使托

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475502411(金幣+5): 2011-06-08 17:11:10

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Originally posted by 475502411 at 2011-06-08 16:29:34:
謝謝您，我才開始設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，還沒有開始做，想跟大家取取經(jīng)，省的走太多的彎路。想問一下問題：
1.目的基因如果用的是Taq 聚合酶是不是就不用進(jìn)行加尾A反應(yīng)了？
2.連接是，連接時(shí)目的基因和載體的摩爾比是3:1 ...

1：這個(gè)沒有什么關(guān)系吧，我們一般都是直接設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后連接的。。。

2：連接的時(shí)候首先根據(jù)你酶切的基因和酶切的基因跑出來的電泳圖，定量看看，如果亮的話可以少加一些，反之亦然；當(dāng)然了，一般連接的時(shí)候目的基因要比載體多一些的。。。

3：轉(zhuǎn)化方法就那么兩種，化學(xué)法或者電轉(zhuǎn)化嘛。。。電轉(zhuǎn)個(gè)人認(rèn)為好一點(diǎn)，省力省時(shí)。。。我們也一直是電轉(zhuǎn)。

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6樓2011-06-08 16:45:03

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Originally posted by 天使托 at 2011-06-08 16:45:03:
1：這個(gè)沒有什么關(guān)系吧，我們一般都是直接設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后連接的。。。

2：連接的時(shí)候首先根據(jù)你酶切的基因和酶切的基因跑出來的電泳圖，定量看看，如果亮的話可以少加一些，反之亦然；當(dāng)然了，一般 ...

目的基因和pGEM-T Easy在題的連接不用酶切吧？我直接將PCR產(chǎn)物純化，跑膠看亮度如何來切丁它的量？不用具體定量嗎？我看說明書上說有。謝謝

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7樓2011-06-08 17:10:57

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Originally posted by zhouying_613 at 2011-06-08 12:15:18:
實(shí)驗(yàn)流程很容易，但是不知道和你的標(biāo)題T-vector有啥關(guān)系？
而且如果是我設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，我肯定是拿突變菌株和野生型做比較，看你要研究的那幾個(gè)基因的表達(dá)差異。你這是要做恢復(fù)突變，確認(rèn)表型的吧？

1.我剛開始做第一步目的基因和載體的連接，接這樣寫了，不妥之處見諒
2.我做的是菌株某一基因突變后對(duì)菌體耐藥，毒力的影響。想將野生型的這段基因通過載體重新轉(zhuǎn)入突變株，看轉(zhuǎn)入前后菌株各方面的變化，以確定該突變對(duì)菌株的影響。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用該合理吧？請(qǐng)指教

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8樓2011-06-08 17:17:34

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