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qurande金蟲 (小有名氣)
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[求助]
129bp小片段從pGEM-T上酶切回收的問題
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129bp的小片段連接到pGEM-T載體上之后，菌落pcr鑒定條帶正確，測序序列正確并且專門在測序結(jié)果中search過引物序列也正確 酶切體系 質(zhì)粒 12ul(大約100ng/ul) bufferD 2.5ul nde1 0.9ul （promega的內(nèi)切酶） sal1 0.9ul 補水到25ul 37度 4h 做兩管反應(yīng)，濃縮 然后跑2%的瓊脂糖膠 兩管酶切產(chǎn)物在一個膠空里跑電泳 當100bp的marker能分清條帶的時候，卻看不見目的條帶 后來我有小量的雙酶切試了試，質(zhì)粒3ul ，內(nèi)切酶分別用0.2ul，10ul體系酶切2h，還是沒有出現(xiàn)目的條帶 希望高手給出指點啊 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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2樓2011-06-01 08:51:31
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
qurande(金幣+1): 謝謝你的建議 2011-06-01 12:07:01
dhd997(金幣+3, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:23
qurande(金幣+1): 謝謝你的建議 2011-06-01 12:07:01
dhd997(金幣+3, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:23
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首先，小片段在膠里的染色信號要弱一些，有可能看不到，建議不要在配膠的時候加EB，而是電泳結(jié)束后用EB去染。 其次，你在大切前是應(yīng)該做小切去確定酶切條件的，先大切失敗然后想到小切是滿痛的一個教訓(xùn)，你老板知道估計要發(fā)飆吧。 最后，小切驗證是要有很多control的，這樣才便于分析，同時切你自己的樣品和別人的已經(jīng)酶切成功過的樣品作為對比，切的時候除了雙切之外還要分別做單切，跑膠的時候每個樣品都有四個lane分別是切前，單切，單切，雙切，這樣才能分析出問題出在哪里。 還有有的時候某個公司的酶針對某個載體就是不好用，那不妨換另一個公司的試試，我們實驗室常用的酶都是有好幾個公司的stock的。 |
3樓2011-06-01 09:12:28
terry130
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【答案】應(yīng)助回帖
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qurande(金幣+5): 說的很到位謝謝 2011-06-01 12:06:40
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:38
qurande(金幣+5): 說的很到位謝謝 2011-06-01 12:06:40
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:38
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看不到條帶很正常，原因如下： 1.PGEM-T載體的分子量約為3000bp，你的片段為130bp左右，那么載體和片段的分子量之比是23:1。 2.你酶切時質(zhì)粒的量約為1200ng，即1.2ug，不知道這個濃度是你測的還是估算的，保守點的話在1ug左右 3.假定EB顯色的機理你都明白，那么酶切完跑膠后片段的亮度應(yīng)為載體亮度的二十三分之一，片段的質(zhì)量約為1000/23約為40ng，其實加上其他的一些損失誤差之類的，很可能到不了這個量 4.你用的mark每條帶都有一個濃度，乘上你加的體積就算這條帶出質(zhì)量了 建議：1.小片段直接用引物擴增后使用，盡量不要通過酶切來獲得，即使跑膠能看到，回收效率也很低，這個你該懂 2.如果執(zhí)意要酶切獲得，只有多切些質(zhì)粒 |
5樓2011-06-01 10:14:00
qurande
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