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complement experiment 相關問題
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我想做complement experiment，現(xiàn)在已經(jīng)得到重組質粒，將臨床分離的突變菌株做成感受態(tài)，用化學轉化的方法。 但是我的菌株本來就有很高的耐藥性，將PGEM-T Easy（amp 抗性）和目的基因的重組質粒轉進去后沒辦法篩選。 我嘗試用藍白篩選，稀釋很多倍，但是得到的全是藍色的菌臺，都連在一起，根本沒有單菌落，再進一步稀釋怕把僅有的但菌落遺漏，導致現(xiàn)在是否轉化成功都不清楚 請高手指點，謝謝 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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T.Shen
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good! 耐藥性可以作為快速篩選的方法，樓下說的有道理。 2011-06-22 15:18:26
西瓜: 考核存檔 2011-06-22 15:20:04
475502411(金幣+8): 2011-06-22 15:53:05
475502411(金幣+4): 2011-07-04 22:13:14
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good! 耐藥性可以作為快速篩選的方法，樓下說的有道理。 2011-06-22 15:18:26
西瓜: 考核存檔 2011-06-22 15:20:04
475502411(金幣+8): 2011-06-22 15:53:05
475502411(金幣+4): 2011-07-04 22:13:14
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1：首先確定你的重組載體沒有什么問題，如果有問題，那么就不能繼續(xù)往下進行實驗了； 2：做互補實驗跟你的菌株耐藥性沒有什么關系。。。你將重組載體轉化進去，為什么還要進行藍白斑篩選呢？藍白篩選理應在你驗證是否連接上的時候才要進行的吧？一般如果你將目的基因成功連接至載體上的時候，做互補只需要將重組載體轉化至突變體中，看看表型有沒有回復至野生型就可以了，當然了，轉化后你只需要提取質粒驗證就可以了； 3：順便說說對照怎么做吧，首先1號：PGEM-T Easy空載體轉化進野生型； 2號：PGEM-T Easy空載體轉化進突變體菌株； 3號：重組載體轉化進突變株； 4號：重組載體轉化進野生型（當然這個可能是多余，但是如果做互補的話，順便帶一個這個，看看你這個基因過量表達的話對菌的表型有什么影響未嘗不可呢？有些基因確實是補不回去，可是過表達它就會有意想不到的表型的）； 4：其實做互補就是將目的基因連接至一個過量表達的載體上然后轉化進突變株中，看看表型可以恢復不？過表達的載體很多，PJN105 PUC系列等等。。。 祝好運！  |
2樓2011-06-22 10:03:14
yuxia82012
木蟲 (著名寫手)
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zboter
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6樓2011-06-22 21:01:16
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