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[求助]
complement experiment 相關(guān)問題
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我想做complement experiment，現(xiàn)在已經(jīng)得到重組質(zhì)粒，將臨床分離的突變菌株做成感受態(tài)，用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法。 但是我的菌株本來就有很高的耐藥性，將PGEM-T Easy（amp 抗性）和目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)去后沒辦法篩選。 我嘗試用藍(lán)白篩選，稀釋很多倍，但是得到的全是藍(lán)色的菌臺，都連在一起，根本沒有單菌落，再進(jìn)一步稀釋怕把僅有的但菌落遺漏，導(dǎo)致現(xiàn)在是否轉(zhuǎn)化成功都不清楚 請高手指點，謝謝 |
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7樓2011-06-22 21:54:15
天使托
專家顧問 (職業(yè)作家)
T.Shen
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+5, EPI+1): Good! 耐藥性可以作為快速篩選的方法，樓下說的有道理。 2011-06-22 15:18:26
西瓜: 考核存檔 2011-06-22 15:20:04
475502411(金幣+8): 2011-06-22 15:53:05
475502411(金幣+4): 2011-07-04 22:13:14
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good! 耐藥性可以作為快速篩選的方法，樓下說的有道理。 2011-06-22 15:18:26
西瓜: 考核存檔 2011-06-22 15:20:04
475502411(金幣+8): 2011-06-22 15:53:05
475502411(金幣+4): 2011-07-04 22:13:14
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1：首先確定你的重組載體沒有什么問題，如果有問題，那么就不能繼續(xù)往下進(jìn)行實驗了； 2：做互補(bǔ)實驗跟你的菌株耐藥性沒有什么關(guān)系。。。你將重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)去，為什么還要進(jìn)行藍(lán)白斑篩選呢？藍(lán)白篩選理應(yīng)在你驗證是否連接上的時候才要進(jìn)行的吧？一般如果你將目的基因成功連接至載體上的時候，做互補(bǔ)只需要將重組載體轉(zhuǎn)化至突變體中，看看表型有沒有回復(fù)至野生型就可以了，當(dāng)然了，轉(zhuǎn)化后你只需要提取質(zhì)粒驗證就可以了； 3：順便說說對照怎么做吧，首先1號：PGEM-T Easy空載體轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型； 2號：PGEM-T Easy空載體轉(zhuǎn)化進(jìn)突變體菌株； 3號：重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)突變株； 4號：重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型（當(dāng)然這個可能是多余，但是如果做互補(bǔ)的話，順便帶一個這個，看看你這個基因過量表達(dá)的話對菌的表型有什么影響未嘗不可呢？有些基因確實是補(bǔ)不回去，可是過表達(dá)它就會有意想不到的表型的）； 4：其實做互補(bǔ)就是將目的基因連接至一個過量表達(dá)的載體上然后轉(zhuǎn)化進(jìn)突變株中，看看表型可以恢復(fù)不？過表達(dá)的載體很多，PJN105 PUC系列等等。。。 祝好運(yùn)！  |
2樓2011-06-22 10:03:14
yuxia82012
木蟲 (著名寫手)
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3樓2011-06-22 12:06:37
4樓2011-06-22 15:59:35
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