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[交流]
【求助/交流】pGEM-T Easy載體 T-A 連接 為啥沒連入PCR產(chǎn)物的 菌斑是藍(lán)斑
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| T載體如果不跟PCR產(chǎn)物連接， 不是由于T末端，自己不能自連嗎? 這樣不應(yīng)該lacZ基因中間斷裂 不能表達(dá)嗎? 為什么沒有連接PCR產(chǎn)物的菌班是藍(lán)色的呢？ |
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23樓2012-03-18 22:05:52
2樓2011-03-07 10:12:02
3樓2011-03-07 10:52:10
★ ★ ★ ★ ★ ★
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與
看天(金幣+5): 鼓勵回答！ 2011-03-07 11:21:08
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與
看天(金幣+5): 鼓勵回答！ 2011-03-07 11:21:08
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如果你們清楚T載體是怎么做出來的，就知道蘭斑怎么來的了。 如果真的是兩端都是T頭，這個T載體是無法自連起來的。 但是為什么會有自連呢？是因為在制作T載體的過程中，除了兩頭是T的情況，不可避免的會還有一頭是T突出，一頭是平端（這個殘留，但是也無法自連），或者兩頭是平端，或者是一頭是T頭，一頭是A頭，或者干脆就是微量的原始環(huán)狀質(zhì)粒無法完全分開，微量的環(huán)狀原始質(zhì)�；煸诰�性T載體成品里面。除了第一種情況一頭T頭，一頭平端無法連接。其它幾種情況加連接酶連接后，都會表現(xiàn)出環(huán)狀的質(zhì)粒，也就是藍(lán)斑點了。至于為什么會混雜這幾種東西，就牽涉到了基礎(chǔ)的原理，和方法了，自己去查資料吧。 做T載體的工藝，就是盡可能的做到，全部是兩頭T頭的載體，這樣理論上就不會有籃斑了。但是這是不可能的，總會混雜上面幾種情況造成藍(lán)斑�；祀s越多，藍(lán)斑比例越多。也就是說明了T載體質(zhì)量越差。這個是判斷T載體好壞的一個最重要指標(biāo)之一。 加T和酶切T載體的方法，沒有可能達(dá)到100%不混雜上面幾種情況。但是本公司做的T載體工藝，藍(lán)色斑點小于10%，很多情況下小于5%，質(zhì)量已經(jīng)是達(dá)到頂級水平。其它公司很多工藝無法達(dá)到，就會出現(xiàn)較多的籃斑，或者兩邊T頭掉了后，兩端成了平端破壞讀碼框自連成白斑的假陽性情況。 |
4樓2011-03-07 11:19:54
5樓2011-03-07 11:21:50
6樓2011-03-07 11:26:55
7樓2011-03-07 11:31:09
★ ★ ★
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與
rainwander(金幣+2): 鼓勵積極參與交流~~~ 2011-03-07 20:01:41
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與
rainwander(金幣+2): 鼓勵積極參與交流~~~ 2011-03-07 20:01:41
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建議樓主好好看看藍(lán)白斑的基本原理~~~~~~~ 如果PCR產(chǎn)物插入了MCS位點，則LAZ基因被截斷，不能表達(dá)，則克隆菌呈白色。 如果沒插入MCS位點，而是自連的話，LAZ基因能表達(dá)，表達(dá)后產(chǎn)物與X-gal產(chǎn)生反應(yīng)，變成藍(lán)色藍(lán)色。 T載體由于制作的問題，是會有自連得。如果沒有自連的話 ，轉(zhuǎn)入細(xì)菌，抗生素基因不能表達(dá)，細(xì)菌就不能在有抗生素的平板上生長。那么就不會產(chǎn)生菌落，產(chǎn)生了菌落的都是含有環(huán)形質(zhì)粒的。 至于T載體為什么會自連，可以看下T載體是怎么生產(chǎn)的，一般都是用Eco5酶切出平末端，然后再平末端上加T尾，加T尾的效率并不是百分百的。 |
8樓2011-03-07 11:56:19
11樓2011-03-07 12:46:13
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天使托
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簡單回復(fù)
2011-03-07 12:32
回復(fù)
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與
zoujin12910樓
2011-03-07 12:38
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198612樓
2011-03-07 12:48
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wg42315樓
2011-03-08 12:14
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