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xnbioinfor

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[交流] 【求助/交流】pGEM-T Easy載體 T-A 連接為啥沒(méi)連入PCR產(chǎn)物的菌斑是藍(lán)斑

T載體如果不跟PCR產(chǎn)物連接，不是由于T末端，自己不能自連嗎? 這樣不應(yīng)該lacZ基因中間斷裂不能表達(dá)嗎? 為什么沒(méi)有連接PCR產(chǎn)物的菌班是藍(lán)色的呢？

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1樓 2011-03-07 09:55:27

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yucheng9255

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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★ ★ ★ ★ ★ ★
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看天(金幣+5): 鼓勵(lì)回答！ 2011-03-07 11:21:08

如果你們清楚T載體是怎么做出來(lái)的，就知道蘭斑怎么來(lái)的了。

如果真的是兩端都是T頭，這個(gè)T載體是無(wú)法自連起來(lái)的。

但是為什么會(huì)有自連呢？是因?yàn)樵谥谱鱐載體的過(guò)程中，除了兩頭是T的情況，不可避免的會(huì)還有一頭是T突出，一頭是平端（這個(gè)殘留，但是也無(wú)法自連），或者兩頭是平端，或者是一頭是T頭，一頭是A頭，或者干脆就是微量的原始環(huán)狀質(zhì)粒無(wú)法完全分開(kāi)，微量的環(huán)狀原始質(zhì)�；煸诰€性T載體成品里面。除了第一種情況一頭T頭，一頭平端無(wú)法連接。其它幾種情況加連接酶連接后，都會(huì)表現(xiàn)出環(huán)狀的質(zhì)粒，也就是藍(lán)斑點(diǎn)了。至于為什么會(huì)混雜這幾種東西，就牽涉到了基礎(chǔ)的原理，和方法了，自己去查資料吧。

做T載體的工藝，就是盡可能的做到，全部是兩頭T頭的載體，這樣理論上就不會(huì)有籃斑了。但是這是不可能的，總會(huì)混雜上面幾種情況造成藍(lán)斑�；祀s越多，藍(lán)斑比例越多。也就是說(shuō)明了T載體質(zhì)量越差。這個(gè)是判斷T載體好壞的一個(gè)最重要指標(biāo)之一。

加T和酶切T載體的方法，沒(méi)有可能達(dá)到100%不混雜上面幾種情況。但是本公司做的T載體工藝，藍(lán)色斑點(diǎn)小于10%，很多情況下小于5%，質(zhì)量已經(jīng)是達(dá)到頂級(jí)水平。其它公司很多工藝無(wú)法達(dá)到，就會(huì)出現(xiàn)較多的籃斑，或者兩邊T頭掉了后，兩端成了平端破壞讀碼框自連成白斑的假陽(yáng)性情況。

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4樓2011-03-07 11:19:54

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sxxuan

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★
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與

最近正在用這個(gè)載體，同樣出現(xiàn)假陽(yáng)性高的現(xiàn)象。
支持一下樓主，求解～

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2樓2011-03-07 10:12:02

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xnbioinfor

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引用回帖:

Originally posted by sxxuan at 2011-03-07 10:12:02:
最近正在用這個(gè)載體，同樣出現(xiàn)假陽(yáng)性高的現(xiàn)象。
支持一下樓主，求解～

謝謝啦

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3樓2011-03-07 10:52:10

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引用回帖:

Originally posted by yucheng9255 at 2011-03-07 11:19:54:
如果你們清楚T載體是怎么做出來(lái)的，就知道蘭斑怎么來(lái)的了。

如果真的是兩端都是T頭，這個(gè)T載體是無(wú)法自連起來(lái)的。

但是為什么會(huì)有自連呢？是因?yàn)樵谥谱鱐載體的過(guò)程中，除了兩頭是T的情況，不可避免的會(huì)還有 ...

那都是T頭的載體如果沒(méi)有連接上PCR產(chǎn)物，不也應(yīng)該是藍(lán)斑嗎？好困惑

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5樓2011-03-07 11:21:50

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198612樓

2011-03-07 12:48 回復(fù)

xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與

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