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[交流]
【求助/交流】pGEM-T Easy載體 T-A 連接 為啥沒連入PCR產(chǎn)物的 菌斑是藍斑
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| T載體如果不跟PCR產(chǎn)物連接， 不是由于T末端，自己不能自連嗎? 這樣不應該lacZ基因中間斷裂 不能表達嗎? 為什么沒有連接PCR產(chǎn)物的菌班是藍色的呢？ |
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5樓2011-03-07 11:21:50
2樓2011-03-07 10:12:02
3樓2011-03-07 10:52:10
★ ★ ★ ★ ★ ★
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與
看天(金幣+5): 鼓勵回答！ 2011-03-07 11:21:08
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與
看天(金幣+5): 鼓勵回答！ 2011-03-07 11:21:08
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如果你們清楚T載體是怎么做出來的，就知道蘭斑怎么來的了。 如果真的是兩端都是T頭，這個T載體是無法自連起來的。 但是為什么會有自連呢？是因為在制作T載體的過程中，除了兩頭是T的情況，不可避免的會還有一頭是T突出，一頭是平端（這個殘留，但是也無法自連），或者兩頭是平端，或者是一頭是T頭，一頭是A頭，或者干脆就是微量的原始環(huán)狀質粒無法完全分開，微量的環(huán)狀原始質粒混在線性T載體成品里面。除了第一種情況一頭T頭，一頭平端無法連接。其它幾種情況加連接酶連接后，都會表現(xiàn)出環(huán)狀的質粒，也就是藍斑點了。至于為什么會混雜這幾種東西，就牽涉到了基礎的原理，和方法了，自己去查資料吧。 做T載體的工藝，就是盡可能的做到，全部是兩頭T頭的載體，這樣理論上就不會有籃斑了。但是這是不可能的，總會混雜上面幾種情況造成藍斑�；祀s越多，藍斑比例越多。也就是說明了T載體質量越差。這個是判斷T載體好壞的一個最重要指標之一。 加T和酶切T載體的方法，沒有可能達到100%不混雜上面幾種情況。但是本公司做的T載體工藝，藍色斑點小于10%，很多情況下小于5%，質量已經(jīng)是達到頂級水平。其它公司很多工藝無法達到，就會出現(xiàn)較多的籃斑，或者兩邊T頭掉了后，兩端成了平端破壞讀碼框自連成白斑的假陽性情況。 |
4樓2011-03-07 11:19:54
簡單回復
198612樓
2011-03-07 12:48
回復
xnbioinfor(金幣+1):謝謝參與
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