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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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angelee

新蟲(chóng) (初入文壇)

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[求助] 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法已有2人參與

求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法。之前，設(shè)計(jì)引物以cDNA為模板擴(kuò)增，結(jié)果沒(méi)有任何條帶，究竟是為什么呢？求解答~

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1樓 2011-12-09 21:45:08

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凌波麗

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【答案】應(yīng)助回帖

3kd-20kd的DNA片段適用長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增。

長(zhǎng)片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無(wú)糾錯(cuò)功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯(cuò)功能）的混合物，以Taq酶為主。
2.當(dāng)需要擴(kuò)增的片段大于20kd時(shí)，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴(kuò)增反應(yīng)的溫度降低2-3度。樓主的擴(kuò)增片段還到不了20kd,甜茶堿可以少加點(diǎn)。
3.適當(dāng)升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。
4.變性時(shí)間要短，尤其是一般不超過(guò)30 s，尤其是模板長(zhǎng)度超過(guò)8KD時(shí)更是如此，變性時(shí)間長(zhǎng)會(huì)破壞模板。
5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時(shí)加長(zhǎng)延伸反應(yīng)時(shí)間，長(zhǎng)度為3-5kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為5-10分鐘，長(zhǎng)度為20-35kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為20分鐘，樓主的PCR的延伸反應(yīng)時(shí)間可能為12-16分鐘左右。
6.模板濃度最好在1ng/L以內(nèi)。
7.應(yīng)用長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液。10X長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的PCR引物（25-30 bp)
其他同普通PCR。

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12樓2014-07-11 10:46:19

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mimi糖砣

新蟲(chóng) (初入文壇)

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引用回帖:

4樓: Originally posted by cxl_yll at 2011-12-10 10:34:26
用takara的la taq酶，我9000都出來(lái)了，不過(guò)概率很小

想請(qǐng)教一下，我最近想克隆七八千左右的，用cDNA克隆，請(qǐng)問(wèn)能不能指點(diǎn)一些細(xì)節(jié)，比如反轉(zhuǎn)錄什么酶比較好，有沒(méi)有檢測(cè)cDNA的質(zhì)量，引物設(shè)計(jì)需要注意什么，有沒(méi)有分段克隆的經(jīng)驗(yàn)？問(wèn)題比較多，非常感謝分享~

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10樓2014-07-10 14:08:04

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cxl_yll

木蟲(chóng) (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

10樓: Originally posted by mimi糖砣 at 2014-07-10 14:08:04
想請(qǐng)教一下，我最近想克隆七八千左右的，用cDNA克隆，請(qǐng)問(wèn)能不能指點(diǎn)一些細(xì)節(jié)，比如反轉(zhuǎn)錄什么酶比較好，有沒(méi)有檢測(cè)cDNA的質(zhì)量，引物設(shè)計(jì)需要注意什么，有沒(méi)有分段克隆的經(jīng)驗(yàn)？問(wèn)題比較多，非常感謝分享~...

我用的LA tag預(yù)混裝的，P了1個(gè)月，就P出5次，你可能需要換一種方法，基本做一次PCR需要10個(gè)小時(shí)吧，3年前做的細(xì)節(jié)忘記的差不多了，我給你回信了...
分段克隆需要找到合適的酶切位點(diǎn)吧，一般好的酶切位點(diǎn)都沒(méi)占用了，還有鏈接的時(shí)候有時(shí)候需要看一下方向...

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11樓2014-07-11 10:03:43

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shaquila

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【答案】應(yīng)助回帖

大片段的反轉(zhuǎn)是個(gè)問(wèn)題哦

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2樓2011-12-10 07:49:21

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zhaoyonggang

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
lstt09nk(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2011-12-10 10:56:18

先看看引物設(shè)計(jì)問(wèn)題，Tm是不是太低了，有沒(méi)有引物二聚體。

如果引物設(shè)計(jì)沒(méi)有問(wèn)題的話，看看cDNA序列中有沒(méi)有高GC含量的片段等difficult 序列。有得話，試試two-step PCR，或者加點(diǎn)DMSO或甜菜堿。去網(wǎng)上google一下吧，會(huì)有有用的信息的。

4Kb不算太大，應(yīng)該是沒(méi)問(wèn)題的。

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3樓2011-12-10 10:03:06

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cxl_yll

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【答案】應(yīng)助回帖

★
lstt09nk(金幣+1): 9000哦，很厲害哦 2011-12-10 10:56:37

用takara的la taq酶，我9000都出來(lái)了，不過(guò)概率很小

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4樓2011-12-10 10:34:26

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lihegang2000

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【答案】應(yīng)助回帖

takara的LA-taq酶可以試試，也可以分兩段或者三段擴(kuò)

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5樓2011-12-10 12:15:53

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世外清風(fēng)

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

基因組DNA擴(kuò)過(guò)沒(méi)問(wèn)題，takara的LA可以，可以嘗試下兩步法試試

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6樓2011-12-10 16:53:41

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chenglong_li

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

問(wèn)題一樣啊，3kb多的片段，擴(kuò)了一個(gè)月，也沒(méi)有好的電泳結(jié)果。
我分析或許與所擴(kuò)增的基因有關(guān)系，其高級(jí)結(jié)果比較復(fù)雜，變性時(shí)間短的話解鏈不充分，變性時(shí)間長(zhǎng)的話造成模板損傷，退火溫度高的話引物與模板結(jié)合不充分，退火溫度低的話造成非特異性條帶，延伸過(guò)程rTaq酶每分鐘1kb。
一些見(jiàn)解，供交流！

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為天地立心，為生民立命，為往圣繼絕學(xué)，為萬(wàn)世開(kāi)太平。

7樓2012-04-02 10:40:59

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wlwabcd

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

TM值，引物，Mg2+濃度等有可能出問(wèn)題。你要擴(kuò)基因組還是cDNA？
如果是基因組的話可以
①先擴(kuò)大片段，回收后以大片段為模板繼續(xù)擴(kuò)增。
②先分段擴(kuò)增，回收后混合作模板擴(kuò)增基因。
如果是cDNA，首先建議你用actin檢測(cè)一下cDNA質(zhì)量。cDNA沒(méi)問(wèn)題建議重新設(shè)計(jì)引物，可以在UTR區(qū)設(shè)計(jì)；或者可以換一種酶試試。我用takara的Primerstar擴(kuò)3k的cDNA完全沒(méi)問(wèn)題，這個(gè)酶的保真性也很好�；蛘逰OD也可以，KOD的擴(kuò)增能力很強(qiáng)，保真性不如Primerstar。

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8樓2012-04-06 21:48:29

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小蛐蛐第一名

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謝謝大家的經(jīng)驗(yàn)，我也遇到同樣的問(wèn)題，好高興呀！

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9樓2012-12-20 21:08:02

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