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[求助]
求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法 已有2人參與
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求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法。之前，設計引物以cDNA為模板擴增，結(jié)果沒有任何條帶，究竟是為什么呢？求解答~ |
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【答案】應助回帖
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3kd-20kd的DNA片段適用長片段PCR擴增。 長片段PCR不同于一般PCR的特殊要求 1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無糾錯功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯功能）的混合物，以Taq酶為主。 2.當需要擴增的片段大于20kd時，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴增反應的溫度降低2-3度。樓主的擴增片段還到不了20kd,甜茶堿可以少加點。 3.適當升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。 4.變性時間要短，尤其是一般不超過30 s，尤其是模板長度超過8KD時更是如此，變性時間長會破壞模板。 5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時加長延伸反應時間，長度為3-5kd的模板延伸反應時間為5-10分鐘，長度為20-35kd的模板延伸反應時間為20分鐘，樓主的PCR的延伸反應時間可能為12-16分鐘左右。 6.模板濃度最好在1ng/L以內(nèi)。 7.應用長片段PCR緩沖溶液。10X長片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.設計較長的PCR引物（25-30 bp) 其他同普通PCR。 |
12樓2014-07-11 10:46:19
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