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[求助]
求助-4Kb的基因P不出來
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有一個4Kb的基因，我需要把它P出來然后夠載體，用cDNA二鏈為模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都試過了，退火溫度也做過梯度，還有，分成兩段進行拼接的方法也用過，都是P不出來。請各位大蝦指點一二，不甚感激��！ [ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ] |
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應(yīng)助 2012-10-18 18:54:02
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采用的是重疊延伸PCR，有些片段是通過兩輪PCR擴增，目的是為了增加重疊區(qū)域的長度，例如， 擴增GH片段， 第一輪擴增所用條件和體系為 模板（cDNA擴增后的片段） 1ul GHu1 1ul GHd1 1ul 10*buffer 5ul dNTP 4ul Taq plus 0.5ul H2O 37.5ul GH片段PCR擴增條件為: 94 ℃ 預(yù)變性 5min、94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸2min30s、72 ℃最后一輪 10min、進行30 循環(huán) 。（GH片段大約為2.5kb) 第二輪擴增條件和體系完全相同，除過模板用第一輪擴增出來的為模板， 我們剛開始時候也擴不出來經(jīng)過分析進行調(diào)整模板濃度、比例以及PCR條件都摸索了好長時間，之后經(jīng)過分析之后，問題可能是：①DG片段的濃度過低，于是，重新擴增DG片段，并用少量的TE回收，目的是為了提高DG的濃度。②PCR程序可能需要進行相應(yīng)的調(diào)整。于是，根據(jù)實驗的結(jié)果，對基因片段的濃度進行相應(yīng)的調(diào)整，并對PCR的程序進行相應(yīng)的改進。即實驗——反饋、改進——再實驗的過程。 |
6樓2012-10-18 12:03:32
7樓2012-10-18 12:22:01
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8樓2012-10-18 16:15:57
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