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yhpzcx鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
500KD左右蛋白的WB該怎么做�。�！ 已有3人參與
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最近在做500KD大小的WB，做了幾次都沒有想要的條帶？ 我的條件是 6%分離膠，4%濃縮膠跑的，大約跑了4h 轉(zhuǎn)膜 0.45PVDF 10%甲醇 0.1%SDS轉(zhuǎn)膜液 一直沒有想要的條帶 不知論壇里的大神們，有沒有做過類似大小的蛋白，給小弟指點(diǎn)迷津  |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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500KD大小的SDS PAGE 電泳的腳就很稀，如果6%分離膠，4%濃縮膠跑的，大約跑了4h能夠成功的話，恐怕會(huì)有不少的蛋白質(zhì)會(huì)穿透凝膠。建議作SDS PAGE 電泳之前先用分子篩充分去除咋蛋白質(zhì)。 然后在轉(zhuǎn)膜時(shí)用事發(fā)轉(zhuǎn)膜，用100V恒壓400mA，轉(zhuǎn)3-4小時(shí)試試看。 但是我覺得如此大的蛋白質(zhì)做WB檢測(cè)根部不合適，因該改變?cè)囼?yàn)方法，樓主的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘裁矗? |
6樓2015-07-16 13:24:23
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【答案】應(yīng)助回帖
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yhpzcx: 金幣+5, ★★★很有幫助, 按這條件轉(zhuǎn)了下，可以轉(zhuǎn)上，不過把層析柜弄壞了。。。。 2015-07-21 17:04:29
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| 以前做過一個(gè)原核蛋白表達(dá)的530kd蛋白，條件跟你的一樣，不知道你的轉(zhuǎn)膜時(shí)間是多少，我的是300ma，低溫過夜，在冷室或?qū)游龉窭镒觥?br /> 最后，什么叫沒有想要的條帶，是什么條帶都沒有？還是說只是沒有目的蛋白的條帶？ |
2樓2015-07-15 09:27:37
yhpzcx
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3樓2015-07-15 10:54:00
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4樓2015-07-15 16:55:28
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5樓2015-07-16 06:31:34
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7樓2015-07-21 17:00:17
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8樓2015-07-21 17:02:01
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9樓2015-07-22 08:46:32
10樓2016-05-27 12:07:37
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