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子非魚ys鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白純化
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本菜鳥純化蛋白幾個月，仍然沒有什么進展，求幫忙指導��！ 我覺得我的問題很多 首先我的蛋白一種 水解酶，試了很多載體，只有pMAL-C2X載體是上清和沉淀有試了其他有HIS，GST標簽，都為沉淀。在MBP純化的時候，上清、沉淀都有表達。超聲破碎，離心，取上清。用12ml注射器純化出來的蛋白沒有活性(1、約2ml填料，自然靜置，10ml水、15mlbuffer,依次平衡，流速約3秒1滴 2、15ml樣品，靜置30分鐘，后流出，10秒1滴（上兩遍） 3、 35ml buffer洗滌 約3秒1滴 4、5ml 洗脫buffer 靜置1h，10秒1滴，5ml 靜置20min，接10ml 5 用超濾管濃縮，更換醋酸鈉緩沖液除鹽 6、測酶活 ）buffer（20mM Tris-hcl 250mM Nacl 1mM EDTA) 在4° 冰箱里操作 蛋白失活 ，掛柱很少，不知道問題出在哪里？？ 第二種方法 用50ml離心管 ，加4ml 填料，1、加5ml純水 3500g/5min (下同）兩遍 2、5ml buffer 離心 2遍 3 加5ml樣品靜置10min 離心，重復3遍 4、5ml buffer 洗脫 5遍 5、洗脫buffer 5ml,靜置1h,離心收集，重復兩次，每次靜置10min 6,、制樣跑膠 （這種濃縮的蛋白有活性） SDS跑膠 結(jié)果：1、流穿液還有很多目的蛋白（結(jié)合率非常低）2、濃縮后，雜帶有6條，目的條帶非常弱（這讓我沒有信心在過分子篩的柱子，標簽蛋白很多（蛋白自身降解了）兩種方法加DTT效果都不明顯 現(xiàn)在在C末端加了6個HIS，雙標簽，才做一次，感覺MBP的結(jié)合還是很低，若先過鎳柱（重力柱），結(jié)合率提高，但是蛋白結(jié)合率還是很少。 求各位指導指導，我不知道問題出在哪，第一步純化都做不好，更別談后面的結(jié)晶了………… |
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子非魚ys
鐵蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 植物生理與生化
2樓2015-07-17 10:28:49
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