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duyang1217鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
請(qǐng)教聚合蛋白解離的方法 已有1人參與
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| 與pet32a重組表達(dá)蛋白，分子量約42-44KD，但是PAGE膠顯示100-130KD之間誘導(dǎo)相對(duì)于為誘導(dǎo)有條差異明顯的帶，懷疑是目的蛋白聚合，但是用his-tag抗體未顯色。我想試試使聚合蛋白解離的方法看看是否可以將此100-130KD的蛋白解離成單體，所以想請(qǐng)教大家聚合蛋白解離的方法，謝謝！ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 蛋白表達(dá)純化與檢測(cè) |
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【答案】應(yīng)助回帖
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拆分蛋白質(zhì)多聚體為單體或者多亞基的蛋白質(zhì)拆分為單個(gè)亞基的試驗(yàn)方法可以參考親和層析的試驗(yàn)方法： （1）改變 pH 值或離子強(qiáng)度：比如可以使用 NaCl 梯度拆解，主要是用于靜電作用引起的相互作用的蛋白質(zhì)多聚體，改變 pH 值可以跟緩沖溶液的組成加入相應(yīng) 的酸或者堿； （2）如果蛋白質(zhì)多聚體主要為疏水相互作用，而且改變 pH 值的結(jié)果不夠有效， 則需要用激烈的條件，比如加入聚乙二醇（最多到 60%，要分梯度加入）或二 甲基亞砜（dimethylsulfoxide）（一般最多到到 10%，要分梯度加入）以降低 水溶液的極性 （3）可以考慮加入去垢劑(表面活性劑)，它們是具有親水基又具有疏水基 的物質(zhì)，能夠在低于臨界膠束濃度（Critical Micelle Concentration ，簡(jiǎn)稱(chēng)： CMC）時(shí)有效結(jié)合于蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，因此一般具有乳化、分散、和增溶作用， 可分陰離子、陽(yáng)離子和中性去垢劑等多種類(lèi)型，中性去垢劑在蛋白提取 鐘應(yīng)用 的較多。 一般考慮使用的是：中性去垢劑或生物表面活性劑。 中性去垢劑 又稱(chēng)非離子表面活性劑，對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用影響較少，宜于蛋白 質(zhì)或酶提取之用。一般市售中性去垢劑有聚乙二醇類(lèi)，如 PEG200；多元醇類(lèi)表 面活性劑，如 山梨醇、司 盤(pán)類(lèi)和吐溫類(lèi)；聚氧乙烯脂肪醇醚，如芐澤類(lèi)、平平加類(lèi)；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如 Igepal CO、乳化劑 OP、Triton、Pluronic(用 作消泡劑、潤(rùn)濕劑、增溶劑)、泡敵。中性去垢劑作用后可通過(guò) Sephadex LH-50 柱除去；也可直接上 DEAE-Sephadex 柱層析分離目的蛋白，不必先除去去垢劑。 也可以用天然表面活性劑 又稱(chēng)為生物表面活性劑，包括種類(lèi)較為廣泛，如 各種樹(shù)膠（阿拉伯膠、杏膠、桃膠、果膠）、明膠、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、 瓊 脂、海藻酸鈉、酪蛋白、膽甾醇、膽 酸類(lèi)、多糖類(lèi)（如環(huán)糊精）等。 具體用法可以參考有關(guān)試劑使用說(shuō)明。濃度盡量低一些為好，濃度不能超過(guò)臨界 膠束濃度（Critical Micelle Concentration ，簡(jiǎn)稱(chēng)：CMC）。 臨界膠束濃度 cmc 的含義如下： 在水中的表面活性劑低濃度時(shí)呈分子狀態(tài)， 并且三三兩兩地把親油基團(tuán)靠攏而分 散在水中， 當(dāng)濃度逐漸增大一定程度時(shí)， 許多表面活性劑分子立刻結(jié)合成大基團(tuán)， 形成“膠束”表面活性劑在水中形膠束所需的最低濃度稱(chēng)為臨街膠束濃度，即 CMC. 意義：CMC 可作為表面活性劑表面活性的一種度量，CMC 越小，表明這種活性劑 形成膠束所需的濃度越低，達(dá)到表面飽和吸附的濃度越低。因而改變表面性質(zhì)從 而起到潤(rùn)濕，乳化，增溶，起泡等作用所需的濃度也越低。此外，臨界膠束濃度 也是表面活性劑溶液性質(zhì)發(fā)生顯著變化的一個(gè)分水嶺，CMC 值對(duì)表面活性劑的研究 有著及其重要的參考價(jià)值的數(shù)據(jù)。 臨界膠束濃度測(cè)定方法很多，用不同方法驗(yàn)證即可 （1）表面張力法 http://www.anatrace.com/tech_tips/TechBul_105.pdf （2）電導(dǎo)率法 方法＆原理 http://151.fosu.edu.cn/hxsy/wuli ... daofajiaosu%20z.htm http://u.edu.cn/UpLoadFile/20080119080151.doc （3）紫外吸收分光光譜 http://www.ilib.cn/A-hxxb200624009.html （4）.芘熒光探針光譜法 http://www.ilib.cn/A-shjsyyy200701012.html 其中芘熒光探針光譜法可信度較高 （5）Critical Micelle Concentration by Conductance and Raman http://ed.augie.edu/~awaspaas/pchem/labs/cmc/cmc.html （4）也可以采用高濃度的（到 3mol/L）的離子解離鹽（比如 KCN 或 KI）或中低 濃 度的變性劑（低于 4mol/L）的尿素或鹽酸胍，都是分梯度加入。 總之，只要能拆解開(kāi)多聚體即可，盡量少或不要變性，拆解后可用分子篩層析方法分開(kāi)各個(gè)亞基或者單體。 |
2樓2015-07-17 21:28:06
duyang1217
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3樓2017-12-04 09:39:55
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