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laqiwe鐵蟲 (正式寫手)
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[求助]
去垢劑CHAPS純化畢赤酵母表達(dá)的膜蛋白 已有1人參與
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| 在畢赤酵母中表達(dá)一膜蛋白，能夠用DDM和TritonX-100純化，但當(dāng)用2%CHAPS(30-40mM,CMC為8mM)溶解酵母膜碎片時(shí)，發(fā)現(xiàn)不能將膜蛋白溶解下來，文獻(xiàn)中有報(bào)道更低濃度CHAPS（5-30mM）溶解其它膜蛋白的案例，不知道為什么我這個(gè)濃度的卻無法將膜蛋白溶下來。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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去垢劑CHAPS解其它膜蛋白的案例主要是對intracullular compartment的報(bào)道，是細(xì)胞內(nèi)膜泡中小分子的溶解，對于跨膜蛋白的溶解，按照跨膜次數(shù)需要加入其他的去垢劑去補(bǔ)充。 就我本人的經(jīng)驗(yàn)，GPCR中的七個(gè)跨膜的蛋白，從哺乳動物細(xì)胞中分離，加入少量的SDS是關(guān)鍵，Igpal 或者 NP40要好于TritonX100，在IP實(shí)驗(yàn)中效果較好，活性試驗(yàn)不敢說。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌捎貌煌膌ysis buffer菜單配方。分級分離后再抽提是一個(gè)可選擇的方案，但是增加了實(shí)驗(yàn)的步驟和時(shí)間。 對于你所說的酵母表達(dá)的膜蛋白，情況與哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的又不一樣。因?yàn)榻湍改ね庥谢|(zhì)成分，需要加入破壞基質(zhì)的試劑。具體參見http://www.protocol-online.org/prot/Model_Organisms/Yeast/Protein/ |
2樓2015-07-20 00:09:21
3樓2015-10-27 21:21:27
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The concentration of detergent is limited and normally no more than 2%, if the lysis buffer is dissolving completely, the phenomena of detergent precipitation can be avoided at 4 celcius degree. I do not know whether or not the occurred precipitations are detergents, as the membrane proteins, the preserved period is less than three days at 4 celcius degree, may be more concentration of salt in lysis buffer better than increase the stable time of proteins according to different protein characteristics. |
4樓2015-10-28 21:47:38
5樓2015-10-29 10:38:50
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Hence, protein purification need to be completed as soon as possible after you determine to do. The pro-experiment is necessary to a feasible plan in each experiment. On the other hand, the preserve condition and check point in the different also need to figure out before beside the bench. Experiments are designed out other than done out. If not, the overtime works have to be done. |
6樓2015-10-30 01:41:38
zwl9426
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
7樓2016-03-19 12:26:23
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