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熒光定量PCR引物的選擇
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植物細(xì)胞提取RNA反轉(zhuǎn)后用自己設(shè)計(jì)的引物做PCR，準(zhǔn)備摸好條件測(cè)序確定為目的基因后交給其他公司做熒光定量， 現(xiàn)在遇到的問題是： 1.擴(kuò)增目的片段為100bp，總是有比100bp大的其他非特異片段干擾，我該如何優(yōu)化條件？ 2.我的樣本有兩種，一種是經(jīng)過光照，另一種為不經(jīng)光照，用同樣的條件同樣的引物擴(kuò)增同一個(gè)基因，但是亮度卻不一樣，比如都是同一個(gè)基因，同一對(duì)兒引物結(jié)果他倆的退火溫度卻不太一致，一個(gè)樣本退火溫度為64度是條帶很亮，而另個(gè)樣本卻在50多度條帶很亮，64度反而不亮，這是正常的嗎？如圖左面數(shù)第五個(gè)孔就是光照樣本64度擴(kuò)增的，同樣的條件左面數(shù)最后一個(gè)孔就是不經(jīng)光照64度擴(kuò)增的，條帶就不亮，我做定量究竟應(yīng)該選哪個(gè)溫度呢？ 3.另外我該選擇什么樣的PCR條件才能保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性？比如條帶單一，擴(kuò)增的很亮？還是不需要很亮，只需要擴(kuò)增出條帶就可以了？ 20150702-4.jpg |
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2樓2015-07-23 11:06:12
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