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追風(fēng)的人偶木蟲 (小有名氣)
呢喃的歌聲
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[求助]
電泳Marker分子量的歸屬問題 已有1人參與
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蛋白樣品為Aβ1-42，單體分子量為4.5 KD。 凝膠用的是Tricine-SDS-PAGE，三層膠，厚度1.5 mm，自己配的。 （圖1）電泳條件是70V，跑了大約15h，怕時間久了溫度太高，所以用了冰浴。 顯色方案是銀染，用的碧云天的快速銀染試劑盒，顯色時間大概在10 min左右。 Marker用的分別是Thermo的26616和26632（圖2）：其中26616是預(yù)染的，我用它來觀察蛋白泳動的情況，標(biāo)注的分子量應(yīng)該沒問題，染色前70 KD的條帶是紅色的，10 KD的條帶是綠色的；26632是非預(yù)染的。 問題是26632指示的分子量該怎么對照： 1、如果按（圖1）中（1）標(biāo)注的，10、15、25 KD的條帶跟26616的能對上，但是3.4和5 KD的條帶不見了，是什么原因造成的？ （（圖3）是猜想它倆跑出去了，換了1 mm厚度的膠來跑，70 V，4 .5h，好像下面也干干凈凈的，啥都沒有）。 2、如果按（圖1）中（2）標(biāo)注的，從下往上依次標(biāo)注，要怎么解釋兩種marker指示的分子量差別那么大？ 之前沒怎么接觸過電泳，最近才開始做，重復(fù)了好多次，都是差不多的結(jié)果，很困惑。請大家給咱指導(dǎo)一下，先謝謝了！ P50710-222121_副本_副本.jpg P50722-145623_副本.jpg P50715-195720_副本.jpg |
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2樓2015-07-23 08:40:05
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3樓2015-08-03 10:23:49
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4樓2015-09-14 15:28:00
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我后來發(fā)現(xiàn)是我的負(fù)極buffer配錯了，才跑不動。換了正確的跑，70V跑到夾層膠，再換120V跑到底，一共用了3個多小時。 第二塊膠背景深是因為試劑盒里的銀溶液用光了，就用了別人配的。平常我用乙醇：醋酸：水=50：10：40固定過夜后，用試劑盒染出來的背景是很淺的。 我現(xiàn)在在摸孵育的時間，文獻(xiàn)上的孵育時間只能做參考。打算加了F12后4度孵育，在不同時間點取樣，不離心，直接變性，看看它們的分子量分布，再決定下一步怎么處理它。 你說的啥都沒有，我沒遇到過，我之前即使是buffer配錯了，也是有條帶的。等我結(jié)果出來了以后，在接著討論吧。寡聚體不好做，共勉！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2015-09-15 14:42:24
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不知道你參考的孵育方法是否跟我一樣，我參考的是W.L.Klein的方法。看了一篇14年的文章，他實驗室驗證自己的方法，可以得到80kDa的球形寡聚體。你再做的時候，可以考慮一下這個情況，因為我用三層膠跑的時候，感覺70kDa往上的條帶，都不怎么跑得進分離膠里來。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2015-09-16 09:04:51
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