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一點靈性新蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白質(zhì)二硫鍵的定量(烷基化法)求助
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本人正在用——碘代乙酰胺和碘代乙酸鈉試劑——的方法,來做蛋白的二硫鍵數(shù)量的測定,但是該方法的Protocol以及試劑的濃度,用量都還不太了解,請大神現(xiàn)身幫個忙吧,小弟感激不盡 |
金蟲 (正式寫手)
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測定總巰基含量時,15 mg蛋白樣品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 緩沖液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。測定自由巰基含量時,15 mg樣品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 緩沖液中,而后加入50 μL Ellman 試劑 (DTNB, 即5,5-二硫基雙2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 緩沖液,4 mg/mL),在25℃條件下保溫反應(yīng)60 min, 離心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 處測定吸光值,以含Ellman 試劑的Tris-Gly 緩沖液為空白對照。 巰基含量的計算公式如下: SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中:A —除去試劑空白后樣品的吸光度值 D—稀釋倍數(shù) C—樣品濃度(mg/mL) 問題1:上述公式中稀釋倍數(shù)D是怎么算的(具體的式子),如果完全按照上述方法是不是就是1? 問題2:我測的物質(zhì)為毛發(fā)固體樣品,二硫鍵含量在350μmol/g附近,此種測試方法是否具有可行性 問題3:由于毛發(fā)樣品中含有非水溶性蛋白,又沒喲測量二硫鍵含量的更好的方法 |

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