 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2092 | 回復(fù): 2 | |||
[交流]
EMSA的實驗方法 已有2人參與
|
|
(1) 如下設(shè)置探針標記的反應(yīng)體系： 待標記探針 (1.75pmol/微升) 2微升 T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升 Nuclease-Free Water 5微升 [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升 T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升) 1微升 總體積 10微升 按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。 (2) 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。 (3) 加入1微升探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應(yīng)。 (4) 再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在30％以上，即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的標記效率。 (5) 標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。 2。 . 探針的純化： 通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作： (1) 對于100微升標記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。 (2) 在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。 (3) 在4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。 (4) 在4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。 (5) 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在 -20℃。 3。EMSA 膠的配制： (1) 準備好倒膠的模具�？梢允褂贸Ｒ�(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當?shù)哪＞�。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。 (2) 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大)。 TBE buffer (10X) 1毫升 重蒸水 16.2毫升 39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2毫升 80% 甘油 625微升 10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) 150微升 TEMED 10微升 (3) 按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理。 4。EMSA結(jié)合反應(yīng)： (1) 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng) 陰性對照反應(yīng)： Nuclease-Free Water 7微升 EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升 細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 0微升 標記好的探針 1微升 總體積 10微升 樣品反應(yīng)： Nuclease-Free Water 5微升 EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升 細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升 標記好的探針 1微升 總體積 10微升 探針冷競爭反應(yīng)： Nuclease-Free Water 4微升 EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升 細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升 未標記的探針 1微升 標記好的探針 1微升 總體積 10微升 突變探針的冷競爭反應(yīng)： Nuclease-Free Water 4微升 EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升 細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升 未標記的突變探針 1微升 標記好的探針 1微升 總體積 10微升 Super-shift反應(yīng)： Nuclease-Free Water 4微升 EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升 細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升 目的蛋白特異抗體 1微升 標記好的探針 1微升 總體積 10微升 (2) 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。 (3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至能觀察到藍顏色即可。 5。 電泳分析： (1) 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。 (2) 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍色)，用于觀察電泳進行的情況。 (3) 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。 (4) 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。 (5) 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當儀器設(shè)備檢測。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有271人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
bio.shk
鐵桿木蟲 (正式寫手)
真相只有一個
- 應(yīng)助: 11 (小學(xué)生)
- 金幣: 7588.6
- 散金: 42
- 紅花: 1
- 帖子: 964
- 在線: 196小時
- 蟲號: 1870835
- 注冊: 2012-06-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
2樓2015-07-30 15:10:07
pjxiongjing
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1102.3
- 散金: 50
- 紅花: 1
- 帖子: 262
- 在線: 54.7小時
- 蟲號: 2674478
- 注冊: 2013-09-23
- 專業(yè): 植物生理與生化
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
xn8008: 歡迎發(fā)帖交流 2016-08-30 08:07:56
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
xn8008: 歡迎發(fā)帖交流 2016-08-30 08:07:56
|
請問你現(xiàn)在的探針是怎么設(shè)計的呢 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-08-29 22:04:30
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 QQ小木 的主題更新
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 北科281學(xué)碩材料求調(diào)劑 +6 | tcxiaoxx 2026-03-20 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 一志愿華中農(nóng)業(yè)071010，總分320求調(diào)劑 +5 | 困困困困坤坤 2026-03-20 | 6/300 |
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | 十三加油 2026-03-21 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿 西北大學(xué) ，070300化學(xué)學(xué)碩，總分287，雙非一本，求調(diào)劑。 +3 | 晨昏線與星海 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩301分求調(diào)劑 +7 | Liyouyumairs 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 +5 | @taotao 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +3 | 呼呼？~+123456 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0805材料320求調(diào)劑 +3 | 深海物語 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 330求調(diào)劑0854 +3 | assdll 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)化學(xué)工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑 +12 | yangfz 2026-03-17 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +10 | yy要上岸呀 2026-03-17 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 083200學(xué)碩321分一志愿暨南大學(xué)求調(diào)劑 +3 | innocenceF 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料專業(yè)求調(diào)劑 +6 | hanamiko 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 22408 344分 求調(diào)劑 一志愿 華電計算機技術(shù) +4 | solanXXX 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿南昌大學(xué)，327分，材料與化工085600 +9 | Ncdx123456 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 司空. 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 招收調(diào)劑碩士 +4 | lidianxing 2026-03-19 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 【同濟軟件】軟件（085405）考研求調(diào)劑 +3 | 2026eternal 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 收復(fù)試調(diào)劑生 +4 | 雨后秋荷 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 277調(diào)劑 +5 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 6/300 |
|