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wangyibo8629新蟲 (初入文壇)
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[求助]
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化總是失敗，請幫助分析下 已有2人參與
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重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多次失敗，請懂的老師幫助分析下原因。試驗(yàn)過程如下:雙酶切分別得到目的基因全序列（約0.8kb）及含同樣酶切位點(diǎn)的載體(約7kb，分別膠回收)，回收片段用T4連接酶連接，但連接之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞沒有菌落長出，多次上述操作重復(fù)都沒有菌落長出，找不到失敗原因很著急，請老師幫助分析下。一開始轉(zhuǎn)化長出過一次，PCR檢測目的條帶大小也正確，但有非特異性條帶，之后再酶切連接轉(zhuǎn)化檢測時(shí)條帶大小都不對(duì)了...酶切膠回收后片段濃度較低，載體濃度為5.5ng/ul，目的片段濃度為0.7ng/ul，連接反應(yīng)體系為:載體1ul，目的片段7.5ul，連接酶0.5ul，buffer1ul。請幫看下哪里有問題，非常感謝。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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董博士
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wangyibo8629: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝 2015-07-31 15:43:48
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wangyibo8629: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝 2015-07-31 15:43:48
| 用PCR鑒定重組質(zhì)粒我個(gè)人認(rèn)為不太準(zhǔn)，還是要看酶切鑒定的結(jié)果，整個(gè)過程中首先你要確定酶切位點(diǎn)沒有錯(cuò)誤，必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)的方向也有注意；建議連接轉(zhuǎn)化時(shí)做對(duì)照組，酶切后的載體做自連接對(duì)照， 如果對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組長出的克隆數(shù)相差不大則很可能存在載體自連或者沒完全切開的情況，建議先不要做后續(xù)驗(yàn)證，重新從酶切開始， 增酶量及酶切時(shí)間、 適當(dāng)減少所切載體的量、改變連接比等；如果對(duì)照組沒有克隆形成或鮮有克隆形成，則可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證，像你這種情況如果自連接對(duì)照都沒有長出菌落，那可以考慮看看是否是感受態(tài)的問題 |
2樓2015-07-31 10:19:44
3樓2015-07-31 12:35:31
wangyibo8629
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7樓2015-08-03 08:23:48
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好的，謝謝董老師，我做下對(duì)照試驗(yàn)試一下*^_^*。因?yàn)槠渌瑢W(xué)也做相關(guān)的試驗(yàn)，感受態(tài)和連接酶應(yīng)該都沒有問題�，F(xiàn)在我擔(dān)心的是會(huì)不會(huì)酶切時(shí)產(chǎn)生星活性，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)改變，影響了后繼試驗(yàn)。做雙酶切時(shí)我用的是Bam H I和Xho I，這兩種酶酶切時(shí)最適溫度不同，一個(gè)是30度一個(gè)是37度(30度也可以），我就都用30度了，酶切之后電泳片段大小是對(duì)的，膠回收之后再連接，之后再轉(zhuǎn)化就總是不長菌落。目的片段和載體的其它序列應(yīng)該都沒有這兩個(gè)酶切位點(diǎn)。但其中一個(gè)酶Xhol連接效率較低，適合平末端的反應(yīng)條件，當(dāng)時(shí)沒注意，酶切時(shí)就選了兩種酶的通用緩沖液，直接把待酶切的DNA和兩種酶、緩沖液加一塊反應(yīng)了，不知道這一步有沒有問題...我再試試，非常感謝老師幫助。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
4樓2015-07-31 15:42:33
MichealXia
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9樓2015-08-12 09:27:56
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