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[求助]
做敲除，希望蟲友能夠分享一點點CRISPR Cas9 px458質(zhì)粒 已有2人參與
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| 想做一個癌細(xì)胞敲除細(xì)胞系，希望大家能夠分享我一點CRISPR px458質(zhì)粒，感謝各位有愛的蟲友！ |
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wufeng1991
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2樓2015-08-06 07:47:09
3樓2015-08-06 10:18:56
4樓2015-08-06 14:03:28
5樓2015-08-06 14:05:28
wufeng1991
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6樓2015-08-06 14:45:58
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Q？ |
7樓2015-08-06 15:00:03
kangaroo0513
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8樓2015-08-07 01:33:29
9樓2015-08-07 09:51:51
【答案】應(yīng)助回帖
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CRISPR/Cas9基因敲除陽性單克隆篩選： 可以采用有限稀釋法篩選單克�。ㄈ绻那贸d體有puro等抗性，需要將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞藥殺后再有限稀釋篩選單克�。唧w步驟如下： 1.將電轉(zhuǎn)后pool細(xì)胞有限稀釋至96孔板中，待3-4個星期后，單克隆細(xì)胞生長至足量，使用Genloci TNA抽提試劑盒提取基因組（針對微量樣品，少到500個細(xì)胞的基因組提�。� 2.PCR敲除位點附近序列（可自行在靶位點前后合適位置設(shè)計檢測引物）、Cruiser™基因敲除檢測試劑盒篩選陽性克隆（錯配酶酶切跑電泳方法）； 3.對第2步初篩的陽性克隆進(jìn)行測序驗證，對于兩個等位基因不同敲除的克隆再進(jìn)行TA克隆后測序驗證，序列比對分析基因敲除情況。 最后篩出我們想要的單克隆。 |
10樓2015-08-17 10:39:23
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