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[求助]
基因敲除中雙交換問題
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大家好： 最近做一個菌的敲除，用的自殺質(zhì)粒介導。單交換已經(jīng)證明了質(zhì)粒整合。雙交換通過SceI酶切割引發(fā)重組。推測PCR檢測會有三種情況，（1）仍為單交換，檢測為大小兩條帶（2）敲除菌， 檢測為小帶（3）恢復(fù)到野生型，檢測大帶。 PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大部分為（1）情況。有少數(shù)是（2）情況。為了確認，對（2）再一次進行重復(fù)驗證，又都變成了（1）的情況了。分析原因，a. SceI表達量低導致酶活不夠，切割能力差。b. 可能已經(jīng)出現(xiàn)敲除子，（2）情況的克隆不太純。c. PCR擴增有些問題。不知道哪里的問題，向大家請教一下。在二次交換是需要注意什么，需要怎么篩選。謝謝  |
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