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布za銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21,卡娜抗性平板轉(zhuǎn)化菌落多，且菌液pcr均為假陽(yáng)性
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求助，第一次做克隆表達(dá)，一直遇到問(wèn)題，希望有人能幫幫我， 目的條帶測(cè)序?yàn)?300多先連接到Takara的pmd-18T，驗(yàn)證后提取質(zhì)粒，與pet28a雙酶切后酶連，雙酶切用的是takara的xho1和NCOL1，酶切后跑電泳會(huì)有大于4500小于質(zhì)粒的條帶，mark用的是Takara的250bp DNA ladder，根據(jù)割膠回收大小在2300的條帶，先轉(zhuǎn)入到DH5a，這一步轉(zhuǎn)化的kn抗性平板也是菌落長(zhǎng)的多且多為假陽(yáng)性，經(jīng)過(guò)多次挑取單菌落得到5株陽(yáng)性菌株，質(zhì)粒pcr為陽(yáng)性，質(zhì)粒電泳只看到單一條帶，但雙酶切目的條帶較淡；質(zhì)粒做過(guò)1微升，0.3微升，0.1微升，1微升質(zhì)粒稀釋30倍和50倍后各區(qū)1微升做轉(zhuǎn)化；1微升，0.3微升，0.1微升的轉(zhuǎn)化平板菌落較多，稀釋30倍和50倍的轉(zhuǎn)化平板菌落較少但菌液pcr仍然都是假陽(yáng)性（多次挑菌落驗(yàn)證）。希望大家能告訴我哪一步出問(wèn)題了改怎么解決？ |
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布za
銅蟲(chóng) (初入文壇)
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2樓2015-08-27 20:36:43
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