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codico銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
真菌的絕對定量熒光pcr如何做標(biāo)準(zhǔn)曲線 已有2人參與
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剛開始接觸熒光PCR，請教大家一個問題： 我的目的是絕對定量樣本中的DNA的提取量，首先要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是標(biāo)準(zhǔn)品如何制作呢？是自己提取核酸，然后通過濃度以及核酸溶液體積計(jì)算核酸總重量，然后通過單個基因組的重量算出拷貝數(shù)，然后做十倍梯度？但是提取的核酸中除了基因組DNA， 還有大量的線粒體DNA(真菌為真核生物)以及RNA，這個計(jì)算一定相當(dāng)不準(zhǔn)確吧。還是說這種標(biāo)準(zhǔn)品是可以購買的？通過什么渠道可以購買到某一特定的菌某一個基因的標(biāo)準(zhǔn)品呢？ 謝謝大家！  |
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高gaoeryang
銀蟲 (小有名氣)
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2樓2015-09-15 17:06:08
biostar2009
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【答案】應(yīng)助回帖
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絕對定量的control不是你這樣搞的 標(biāo)準(zhǔn)品是一個濃度，或者自定義單位已知的東西（比如滴度，要知道待測品和標(biāo)準(zhǔn)品之間的關(guān)系）。 比如，已知序列/分子量，質(zhì)量的某一段體外轉(zhuǎn)錄RNA；已知序列/分子量，質(zhì)量的某一段質(zhì)粒，這些RNA/質(zhì)粒上帶有你引物可以擴(kuò)增的片段或者直接帶有你PCR得到的全部片段， 對于你這種直接測基因組DNA的待測品，就沒必要整RNA了，直接用質(zhì)粒DNA，或者純化的PCR產(chǎn)物，定量后就行。 用這個做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在Ct和絕對濃度之間得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算你的檢測樣品濃度。 |
3樓2015-09-15 19:25:19
4樓2017-10-06 18:48:32
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