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報(bào)告基因的載體的構(gòu)建
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IHF對(duì)病原細(xì)菌致病性的分子機(jī)理研究 （A）靶基因啟動(dòng)子預(yù)測 在上述研究的基礎(chǔ)上，找出受IHF調(diào)控的靶基因，應(yīng)用分子生物學(xué)軟件，對(duì)IHF所調(diào)控的靶基因啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測分析，找出其保守的區(qū)域。 （B）啟動(dòng)子報(bào)告基因構(gòu)建 分析靶基因啟動(dòng)子區(qū)域，將Gus(β-glucuronidase)報(bào)道基因（gusA）的編碼序列連接到靶基因啟動(dòng)子下游，得到的融合基因分別導(dǎo)入野生型菌株和IHF突變菌株中，定量檢測GUS活性；通過截?cái)喾绞�，明確IHF調(diào)控的啟動(dòng)子長度，通過生物信息學(xué)分析，確定IHF調(diào)控的啟動(dòng)子可能序列特征。 （C）IHF與靶基因啟動(dòng)子DNA結(jié)合分析 根據(jù)上述研究結(jié)果，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)域，同位素標(biāo)記，構(gòu)建IHF表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化IHF蛋白，通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）以確定IHF是否直接與啟動(dòng)子DNA結(jié)合，來調(diào)控下游基因表達(dá)。 （D）IHF與啟動(dòng)子結(jié)合位置和序列分析 確定能與IHF特異結(jié)合的啟動(dòng)子后，通過DNase 1 足跡實(shí)驗(yàn)（DNase experiment 1 footprint），進(jìn)一步明確IHF蛋白在啟動(dòng)子上的結(jié)合位置和序列。 希望有大神伸出援助之手，有公司可以做也行，跪求啦�。。。。。�  |
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