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Queetree新蟲 (初入文壇)
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[求助]
如何提高公司定做的血清抗體的效價~~~~ 已有3人參與
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事情是這樣的：我實驗室用的抗體是通過公司制作的，來自于小鼠的心臟取血，最近用這個抗體做WB抗我從Hela細胞中提取的總蛋白卻抗不出任何條帶，懷疑是抗體效價降低的緣故（做了很多對照實驗找出問題出在抗體上），希望求助得到能提高抗體效價的辦法？？？？？ 之前也看過很多論壇的帖子，總結(jié)下來大致提出了兩條解決辦法： 1、用Protein A/G純化抗體，然后用Elution Buffer洗脫。 2、將抗原滴在PVDF膜上，用抗原純化抗體。 看起來很簡單，那么問題來了，第一種辦法用Elution Buffer洗脫后的抗體能直接用于WB實驗嗎？第二種辦法里并沒有說用什么試劑可以將抗體從膜上洗下來，就算找到了試劑能洗脫的，但既然能洗脫必然破壞了抗原和抗體的特異性結(jié)合，那么用在洗脫液里的抗體做WB理論上也沒法跟抗原結(jié)合了��？？？ 求各位大俠告訴我應(yīng)該怎么辦？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1用proteinA/G的洗脫液洗脫的ab，挑PH后可以用于與抗原結(jié)合，我純化的ab就用1M This挑ph到7附近就可以直接用于ELISA了 2洗脫后會發(fā)生你說的情況，但及時調(diào)整ph或者去除其他變性條件，ab是可以回復(fù)的，依然可以用于與ag的結(jié)合 至于你WB做不出來的原因，一個可能是目標(biāo)蛋白含量太低，需要進行一些純化工作提高含量；一個有可能是因為目標(biāo)蛋白經(jīng)過PAGE，蛋白變性，構(gòu)型改變導(dǎo)致ab不能識別，可以用純的蛋白做WB測試一下是不是這個原因。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-08-28 18:10:44
Queetree
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3樓2015-08-28 22:45:02
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4樓2015-08-28 22:47:55
【答案】應(yīng)助回帖
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SDS-PAGE中會有很多因素導(dǎo)致蛋白變形，比如加熱、SDS、巰基乙醇。你應(yīng)當(dāng)先驗證是不是這個原因，再考慮非變性電泳。至于非變性電泳，你跟網(wǎng)上搜native PAGE就有，我NATURE PROTOCOL有詳細的步驟。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2015-08-28 23:00:49
6樓2015-08-28 23:02:21
7樓2015-08-28 23:05:29
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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一般四中可能，雖然我沒做WB。 1.人，你做了很多對照實驗問題出在抗體上，而這個抗體是別的公司制作的，就是商品，商品不合格你先找制作的公司，讓他們跟你提高效價，當(dāng)然前提確實是抗體有問題，而不是你的對照實驗過程有問題。 2.你做WB時的環(huán)境，比如無菌啊，環(huán)境溫度啊，酸堿環(huán)境啊，有無還原劑啊，有無是蛋白變性的物質(zhì)啊。環(huán)境是否存在污染物。 3.你做WB的實驗方法是否是正確合理的，包括你驗證抗體的實驗，方法不對，有好的結(jié)果的可能性不大，也包括你提總蛋白的方法。 4.你用的抗體有問題或者你提取Hela細胞中總蛋白，提取出來時已經(jīng)失活變性了，還有包括你驗證的實驗用的蛋白是否有活性。若你驗證的材料方法有問題，那很難說明是抗體有問題。當(dāng)然相信你驗證的方法材料沒問題。 那么問題來了，既然是抗體的問題，抗體有是買的商品，那直接找供貨方，你要自己處理，方法你也知道啊，那先試驗啊，看結(jié)果。 綜上所述，抗體效價不夠，出問題的可能性不大，方法材料出問題的可能性比較大。祝順利。 |
8樓2015-08-29 20:11:54
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9樓2015-08-29 21:40:57
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10樓2015-08-29 21:45:14
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