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上帝的飲料新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌BL21（DE3）都表達(dá)哪些蛋白質(zhì)啊 已有2人參與
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| 最近在做使用雙水相萃取的方式純化目的蛋白，BL21(DE3)做表達(dá)菌株，破壁后直接使用雙水相萃取。跑SDS后發(fā)現(xiàn)，一部分雜帶被去除了，但還是有一些雜帶保留了，按理說(shuō)這些雜蛋白應(yīng)該都是疏水的，想問(wèn)一問(wèn)大神都表達(dá)了哪些疏水性的蛋白質(zhì)啊 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。 目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但CaCl2 法簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15%的無(wú)菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。 一. 材料 E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS質(zhì)粒DNA: 購(gòu)買(mǎi)或?qū)嶒?yàn)室自制，eppendorf管。 二. 試劑 1.LB固體和液體培養(yǎng)基：配方見(jiàn)第一章。 2.Amp母液：配方見(jiàn)第一章。 3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲(chǔ)存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。 4.麥康凱培養(yǎng)基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。 5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無(wú)水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。 6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無(wú)水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。 三、操作步驟 1. 受體菌的培養(yǎng) 從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 =0.5左右。 2. 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法) 1）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。 2）棄去上清,用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。 3）棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。 4）感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。 文章來(lái)源英格恩博客 |
2樓2015-08-29 10:02:41
上帝的飲料
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
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- 蟲(chóng)號(hào): 3295050
- 注冊(cè): 2014-06-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 電磁場(chǎng)與電路
3樓2015-08-29 10:39:12
4樓2015-08-29 10:44:41
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