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長(zhǎng)虎牙的羊金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
熒光定量目的基因復(fù)孔的重復(fù)性不好，而內(nèi)參基因重復(fù)性卻很好。急求大神幫忙。
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| 小的我最近在重復(fù)師姐做的熒光定量的實(shí)驗(yàn)，但是換了一種細(xì)胞系（都是人的細(xì)胞，我用的是HepG2），之前的細(xì)胞系已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)引物是沒(méi)有問(wèn)題的。我連著做了三遍，結(jié)果就是目的基因的重復(fù)性非常不好。昨天又做了一遍，結(jié)果還是醬紫，oh，我的內(nèi)心是奔潰的�。。。。�！所用試劑應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，都是新買(mǎi)的PROMEGA的試劑，RNA是用omega試劑盒提的，260/280為2.07。請(qǐng)各位大神幫幫我吧。 |
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jackyoung
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【答案】應(yīng)助回帖
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從比值看，RNA完整性應(yīng)該可以接受（如果是nanodrop測(cè)定的話(huà)，分光光度計(jì)法得到這樣的值多半是降解的）。有一點(diǎn)需要確定，即所說(shuō)的重復(fù)是實(shí)驗(yàn)重復(fù)還是技術(shù)重復(fù)？如果是實(shí)驗(yàn)重復(fù)，建議考慮優(yōu)化提取-反轉(zhuǎn)錄過(guò)程（指控制好RNA質(zhì)量和反應(yīng)體系中樣品的用量，同一批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，消除可能的影響），重新定量后取均值即可，如果變異大可能是正常的。另外告訴你幾個(gè)事實(shí):1.cDNA多次凍融或存放時(shí)間較長(zhǎng)會(huì)引起降解（尤其反轉(zhuǎn)錄后沒(méi)有熱失活RT的）;2.RNA的質(zhì)量和投入多少會(huì)影響反轉(zhuǎn)的效率，尤其是各種細(xì)節(jié)控制不好（多加或少加，混合不均勻，有影響酶活性的酒精、酚、胍等存在的時(shí)候）;3.儀器的問(wèn)題（之前是公共儀器，某幾個(gè)個(gè)別位置甚至整排有問(wèn)題，小概率） 問(wèn)題可能千奇百怪，知道原理，懂得避免，盡量靠譜就好。祝好。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
長(zhǎng)虎牙的羊
5樓2015-09-11 01:06:40
wozaitianda
禁蟲(chóng) (小有名氣)
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3樓2015-09-01 22:51:42
長(zhǎng)虎牙的羊
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4樓2015-09-06 08:50:36
長(zhǎng)虎牙的羊
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6樓2015-09-13 09:43:59
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