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QIIME--16s測序生物信息培訓課程(原創(chuàng)) 已有6人參與
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QIIME--16s測序生物信息培訓課程(原創(chuàng)) 名詞解釋 16S rRNA 16S rRNA 基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，長度約為1542bp，其分子大小適中，突變率小，是細菌系統分類學研究中最常用和最有用的標志。其序列包含可變區(qū)（Variable region）和保守區(qū)（constant region）。可變區(qū)序列因細菌而異，且變異程度與細菌的系統發(fā)育密切相關，通過提取環(huán)境樣品的DNA，并擴增和檢測其中的一段或幾段區(qū)域，可以了解環(huán)境樣品(土壤、腸道、海洋)中細菌的種類和豐度。 OTU 如果序列之間，比如不同的 16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定義為一個OTU，每個OTU對應于一個不同的16S rRNA序列，也就是每個OTU對應于一個不同的細菌（微生物）種。通過OTU分析，就可以知道樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。 測序區(qū)域 由于16s rDNA較長（1.5kb），考慮到測序平臺的讀長限制，我們只能對可變區(qū)進行測序。16s rDNA包含有9個可變區(qū)，分別是v1-v9。一般我們對v3，v3-v4和v6可變區(qū)域進行擴增和測序。 主要內容 QIIME安裝 測序數據處理 OTU分析與注釋 Venn圖繪制 Heatmap圖繪制 樣品復雜度分析 (Alpha diversity) 多樣品比較分析 (Beta diversity) 系統樹的構建 其他分析 詳細內容 1.Qiime的安裝(http://qiime.org/) 在http://qiime.org/官網下載VirtualBox和QIIME虛擬機，然后安裝VirtualBox，導入QIIME虛擬機，具體圖示如下。  我的電腦為什么安裝不了？那是因為您的電腦可能沒有開通VT(virtualization technology)，趕緊進入BIOS開通吧。 2.Linux常見命令 大家如果沒有用過linux的話，請學會一下幾個常用的linux命令吧。如果大家想對我們的課程有詳細的詳解的話，大家可以在掏寶搜索“16s測序分析”就能找到我們的課程了。 cd 切換到目錄 pwd 顯示當前目錄完整路徑 mkdir/touch 新建目錄/文件 ls 查看文件與目錄 cp 復制文件 mv 移動文件、目錄或更名 rm 刪除文件或目錄 zip/tar 解壓縮文件 history 查看歷史命令 wget 命令行的下載工具 shutdown/reboot 關機/重啟 3.FASTQ數據下載 主要有以下兩個網站下載原始的FASTQ： EBI (http://www.ebi.ac.uk/) SRA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) 4.樣品信息文件(map.txt) #SampleID BarcodeSequence LinkerPrimerSequence SampleType Description SRR1370913 AGCTGACTAGTC GTGCCAGCMGCCGCGGTAA tumor SRR1370913 SRR1370914 AGCTGACTAGTG GTGCCAGCMGCCGCGGTAA tumor SRR1370914 SRR1370915 AGCTGACTAGTA GTGCCAGCMGCCGCGGTAA normal SRR1370915 SRR1370920 AGCTGACTAGTT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA normal SRR1370920 第一列必須是#SampleID，為可區(qū)分的數字，字母或 。每一行的這個值應該是唯一的。 第二列必須為BarcodeSequence。每一行的這個值應該是唯一的。 第三列必須為LinkerPrimerSequence，為擴增樣品的引物。 后面的列可以根據樣品的特點加以描述，但是每一列必須包含至少兩個值，就是指定樣品信息，就可以在這個位置設置了。 最后一列必須是Description。每一個樣品不一樣的地方，必須不一樣額。 5.join_paired_ends.py (fastq-join) 6.質量過濾 (split_libraries_fastq.py) convert to fasta Read too short after quality truncation N characters 7.OTU分析與注釋--pick_open_reference_otus.py pick_otus.py------從fasta文件中提取OTUs，提取方法有cd-hit，blast，Mothur，usearch。 make_otu_table.py-------將提取出的OTUs制作成out_table，即.biom文件。 assign_taxonomy.py------使用reference中的reference_seqs和 taxonomy文件對序列分類。 biom add-metadata-------將taxa數據加入到.biom文件。 8.Venn圖繪制 使用VennDiagram package可以輕松獲得和高水平文章上類似的Venn（維恩）圖，代碼如下： 9.Heatmap圖 10.core_diversity_analyses.py（Alpha和Beta分析） single_rarefaction.py------Rarify the OTU table beta_diversity.py-------beta多樣性 principal_coordinates.py------PCoA圖形化 alpha_diversity.py-------Alpha多樣性 make_rarefaction_plots.py-------稀釋曲線 summarize_taxa.py------Summarize Taxonomy plot_taxa_summary.py------Taxa summary plots Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統內的多樣性，常用的度量指標有Chao1 豐富度估計量（Chao1 richness estimator） 、香農多樣性指數（Shannon diversity index）、辛普森多樣性指數（Simpson diversity index）等。 計算菌群豐度：Chao； 計算菌群多樣性：Shannon、Simpson。 Chao1：是用chao1 算法估計群落中含OTU 數目的指數，chao1 在生態(tài)學中常用來估計物種總數，由Chao (1984) 最早提出。Chao1值越大代表物種總數越多。 計算公式：Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1) Shannon-Wiener 曲線，是利用shannon指數來進行繪制的，反映樣品中微生物多樣性的指數，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。 當曲線趨向平坦時，說明測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物物種信息。 Simpson：用來估算樣品中微生物的多樣性指數之一，在生態(tài)學中常用來定量的描述一個區(qū)域的生物多樣性。Simpson 指數值越大，說明群落多樣性越高。 Rank-Abundance曲線：同時解釋樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。橫坐標代表物種排序的數量；縱坐標代表觀測到的相對豐度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。而曲線快速陡然下降表明樣本中的優(yōu)勢菌群所占比例很高，多樣性較低。 Beta多樣性是生態(tài)系之間的種多樣性，它包含分類單位的比較生態(tài)系內的每一獨特性。即衡量群落之間的差別。Beta多樣性不僅描述生境內生物種類的數量，同時也考慮到這些種類的相同性及其彼此之間的位置。不同生境間或某一生態(tài)梯度上不同地段間生物種類的相似性越差，Beta生物多樣性越高。 PCoA分析，即主坐標分析（PCoA，Principal Coordinate Analysis）可以從復雜的多維度數據中提取和可視化展示主要的高信息量突變,與PCA的主要思想類似。它將距離矩陣的信息轉變成在一系列直交軸中顯示，這樣某種變量的最大值體現在第一個成分坐標中，而另一種變量的最大值體現在另一個成分坐標上。距離越近的點代表樣本間相似度越高，理論上生物學重復的樣本應該聚在一起。 11.系統樹 系統發(fā)生樹（英文：phylogenetic tree或evolutionary tree）是表明被認為具有共同祖先的各物種相互間演化關系的樹，又被稱為系統發(fā)育樹、系統演化樹、系統進化樹、種系發(fā)生樹、演化樹、進化樹、系統樹。 它用來表示系統發(fā)生研究的結果，用它描述物種之間的進化關系。 filter_otus_from_otu_table.py------挑選豐度>1‰的OTU filter_fasta.py------獲得豐度>1‰OTU的fasta文件 make_phylogeny.py-------構建系統樹 ggtree.R------系統樹可視化 為了更好的展示系統樹，我們采用了最新的ggtree R包實現系統樹的可視化。我們主要展示兩個系統樹，即circos樹和熱圖樹。ggtree.R代碼如下： 12.差異OTU分析 對找到的OTU，我們會分析其在各個樣品中的豐度，分析每個OTU在對照組和實驗組中的差異情況。 OTU baseMean log2FoldChange stat pvalue padj taxonomy 1787644 44.801 4.315 4.364 1.28E-05 0.012 k__Bacteria; p__Cyanobacteria; c__Chloroplast; o__Streptophyta; f__; g__; s__ 539866 68.372 4.198 4.058 4.95E-05 0.028 k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteobacteria; o__Thiotrichales; f__Piscirickettsiaceae; g__; s__ 特別聲明，此文章是作者原版，如需要轉載，請與作者聯系。大家如果對該課程該興趣，可以查看作者的用戶名，也可以在掏寶搜索“16s測序分析視頻”或者“生物信息視頻”。 1.png 2.png 3.png 4.png 5.png 6.png 7.png 8.png 9.png 10.png 11.png 12.png 13.png 14.png 15.png 16.png 17.png 18.png 19.png 20.png 21.png 22.png 23.png 24.png 25.png 26.png 27.png 28.png |
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