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三代單分子實(shí)時(shí)測(cè)序與細(xì)菌全基因組修飾分析
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三代測(cè)序，除了具有讀長更長之外，還有一個(gè)很重要的優(yōu)勢(shì)，就是能夠同時(shí)測(cè)得基因組甲基化修飾的信息。這帶來了一個(gè)新的視角，讓我們?cè)讷@得細(xì)菌完成圖的同時(shí)，還可以了解基因組在表觀層面的變化，從更多角度來解析細(xì)菌基因組的基因密碼。 甲基化修飾是什么？ 我們都知道，常見的生命遺傳編碼是由DNA承載的，DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，編碼核心就是帶有ATGC四種不同堿基的脫氧核糖核酸。而實(shí)際上在生物體內(nèi)很多時(shí)候DNA的堿基形式不是單純的ATGC堿基，其中A和C兩種堿基經(jīng)常會(huì)存在一些甲基化修飾的現(xiàn)象，如下圖所示： 圖1 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的三種常見甲基化修飾方式[1] 為什么要研究甲基化修飾？ DNA的甲基化修飾會(huì)影響到其與配對(duì)堿基之間結(jié)合的化學(xué)動(dòng)力學(xué)過程，進(jìn)而使基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)受到影響。反應(yīng)到表觀層面，細(xì)胞不同生長周期下，不同位置的甲基化修飾起到了重要的輔助功能[2,3]。 圖2 細(xì)菌細(xì)胞不同周期的甲基化改變[3] 同時(shí)DNA的甲基化修飾對(duì)于部分細(xì)菌的毒力表現(xiàn)也起著相當(dāng)重要的作用。某些基因的改變，甚至?xí)绊懙饺蚪M的甲基化水平，進(jìn)而影響到整個(gè)菌株的毒力性狀表現(xiàn)[4]。 圖3 6個(gè)不同菌株的基因差異（A）和不同菌株毒力基因甲基化水平的改變（B)[4] 三代測(cè)序如何測(cè)得甲基化信息？ 三代PacBio平臺(tái)的測(cè)序方法為單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（Single Molecule Real Time, SMRT），是基于單分子底物邊合成邊測(cè)序的方法。由于甲基化修飾過的堿基，其同配對(duì)堿基結(jié)合的化學(xué)動(dòng)力學(xué)會(huì)有所差異，在底物堿基被甲基化修飾時(shí)，檢測(cè)到的測(cè)序信號(hào)就會(huì)發(fā)生改變，如下圖所示： 從圖中可以看到，底物甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)信號(hào)會(huì)有一個(gè)明顯的延時(shí)。PacBio的測(cè)序儀就是通過這個(gè)特征，辨認(rèn)出底物中的甲基化位點(diǎn)的。同時(shí)，由于甲基化的信號(hào)取決于底物的甲基化特征，所以實(shí)際上我們最終獲得的不僅有甲基化位點(diǎn)信息，還可以同時(shí)得知甲基化具體是發(fā)生在基因組的哪條鏈上。這也為后續(xù)的分析提供了更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。 細(xì)菌完成圖的甲基化修飾分析 有了三代測(cè)序這個(gè)方便的平臺(tái)，我們能夠在拼接得到完整的細(xì)菌基因組同時(shí)，還能同時(shí)獲得兩條鏈上的甲基化修飾信息，具體展示示例如下圖： 圖5 完成圖圈圖展示，由內(nèi)至外各圈依次為：GC偏離，GC含量，ncRNA，表觀修飾情況位點(diǎn)分布情況，GO功能分類，COG功能分類，基因分布情況 天津生物芯片采用基于PacBio RS II第三代測(cè)序技術(shù)的技術(shù)平臺(tái)，利用其長讀長、高精度、均勻覆蓋基因組等特點(diǎn)，結(jié)合獨(dú)家的基因組組裝策略，開啟功能基因組研究新時(shí)代！ 細(xì)菌基因組完成圖測(cè)序最新解決方案： 解決方案優(yōu)點(diǎn)： 測(cè)序周期短； 測(cè)序成本低； 測(cè)序準(zhǔn)確性高：PacBio長讀長減少大尺度連接錯(cuò)誤，Illumina數(shù)據(jù)減少單堿基錯(cuò)誤； 實(shí)驗(yàn)范圍廣泛：該策略不受GC含量影響，特別適合于極端環(huán)境來源細(xì)菌，如放線菌、粘細(xì)菌等 真菌基因組測(cè)序最新解決方案： 該解決方案優(yōu)點(diǎn)： 測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性高：結(jié)合不同測(cè)序平臺(tái)，減少測(cè)序和拼接錯(cuò)誤; 拼接結(jié)果完整性高：該測(cè)序方案可獲得NGS測(cè)序無法獲得的基因組區(qū)域，基因組完整性高，利用光學(xué)圖譜平臺(tái)，甚至可拼接獲得真菌著絲粒和端粒序列信息，獲得染色體級(jí)別拼接結(jié)果； 適用范圍廣泛：該方案很好低適用于GC異�；蚧蚪M中存在大量重復(fù)區(qū)的真菌，能夠很好GC異常區(qū)域序列信息及跨越重復(fù)區(qū)； 參考文獻(xiàn) 1Davis BM, Chao MC, Waldor MK. Entering the era of bacterial epigenomics with single molecule real time DNA sequencing. Current opinion in microbiology. 2013, 16(2), 192-198. 2Gonzalez D, Kozdon JB, McAdams HH, et al. The functions of DNA methylation by CcrM in Caulobacter crescentus: a global approach. Nucleic acids research. 2014, 42(6), 3720-3735. 3Kozdon JB, Melfi MD, Luong K, et al. Global methylation state at base-pair resolution of the Caulobacter genome throughout the cell cycle. Proceedings of the National Academy ofSciences. 2013, 110(48), E4658-E4667. 4Manso AS, Chai MH, Atack JM, et al. A random six-phase switch regulates pneumococcal virulence via global epigenetic changes. Nature communications. 2014, 5. 5Pacific Biosciences official website: http://www.pacb.com/applications/base_modification/ 轉(zhuǎn)自：測(cè)序中國 |
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