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[求助]
急！PCR產(chǎn)物做模板，改變primer做第二次PCR，無條帶！ 已有1人參與
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求助： 想通過三次PCR，延長序列，目標(biāo)size：5kb 第一次PCR，5kb處為主帶，下方small size有雜帶，為避免下次PCR干擾，切膠回收產(chǎn)物，純化后跑膠，再無雜帶，條帶清洗明亮。 用該產(chǎn)物做第二次PCR，希望在5‘端加入50bp，故此次PCR的5’primer為70bp，其中有28bp與第一次PCR primer重合，3‘ primer與第一次完全相同25bp，做第二次PCR，怎么做，都沒有結(jié)果，只有非常小的區(qū)域有雜帶。嘗試更換新的酶（Phusion）和buffer，嘗試不同的program都無效，98°熱啟動，98°：30’’，61°：30’’，72°：2’30’’，優(yōu)化過不同的退火溫度，也用過4’的延長時間，都是一點產(chǎn)物都沒有。查了很多資料，看了很多帖子，不知道問題究竟出在哪里。 請教各位，問題出在哪里，有做過類似的實驗請給點建議。 謝謝！ |
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kangaroo0513
新蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-20 16:55:55
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最近我也遇到了相同的問題。更換引物吧，有的引物就是特別難P，我也不知道為毛。。。我做點突變，用重疊PCR，4個點突變，只有一個的重疊前半段P不出，其他的都好好的。。。 最近的經(jīng)驗值= 1.降低退火溫度，試試gradient看看能不能跑出來目的條帶 2.重新設(shè)計引物，不匹配區(qū)的堿基換換。。我能跑出來的引物和不能跑出來的引物就差兩個堿基，相同位置一個是G一個是A。。。 |
2樓2015-09-03 15:59:31
弱者退散
鐵蟲 (小有名氣)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
3樓2015-10-20 16:06:18
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