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[交流]
請(qǐng)問(wèn)體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法 已有1人參與
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| 聽說(shuō)有一種可以試劑與核酸混合后，直接注射小鼠，3天出結(jié)果的活體轉(zhuǎn)染技術(shù)，誰(shuí)知道具體方法是什么呀 |
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xiaomili1206
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 生物化學(xué)
2樓2015-09-08 10:04:32
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1.核酸劑量。核酸尾靜脈給藥的起始劑量為0.625mg/kg。一般給藥劑量越高，效果越好，以不造成動(dòng)物炎癥和死亡為標(biāo)準(zhǔn)。下表是一些常見的給藥劑量和體積。 表1 給藥劑量和體積 給藥途徑 核酸用量 最大給藥體積 成年小鼠 尾靜脈 50-150μg 200μl-600μl 腦室 1-2.5μg 5μl 腹膜 100μg 0.6ml-1ml 睪丸 3-5μg 10μl 裸鼠 皮下腫瘤 10-50μg 100μl 成年大鼠 腦室 2-5μg 20μl 尾靜脈 500μg-2.25mg 1-2ml 成年兔 肺，氣管灌注 300-700μg 300-700μl 2.核酸的要求。建議用純水溶解，并且要高純度和無(wú)內(nèi)毒素。核酸的濃度建議在0.5-1ug/ul。核酸的純度會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率，一定要采用高純度高質(zhì)量核酸。 3. EntransterTM-in vivo的用量。一般情況下，核酸(μg)和EntransterTM-in vivo (μl)按照1:2的比例使用。 4.尾靜脈注射：需要用葡萄糖溶液稀釋。下表是采用0.625mg/kg情況下，尾靜脈注射20g體重小鼠，注射量為100μl時(shí)各成分組成（核酸濃度1μg/μl）。 表2 尾靜脈注射100ul轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成 100μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物 核酸稀釋液 12.5μg(12.5μl)核酸 12.5ul水 25μl的10%葡萄糖溶液 轉(zhuǎn)染試劑稀釋液 25μl轉(zhuǎn)染試劑 25μl的10%葡萄糖溶液 5.局部注射：首先確定需要最終注射的最大體積。最大體積確定后，根據(jù)核酸(μg)：轉(zhuǎn)染試劑(μl)=1:2來(lái)確定各用量，比如：局部注射量為30μl時(shí)各成分組成，其中核酸濃度1μg/μl（可以用生理鹽水或者純水溶解）。 表3 局部注射30ul轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成 30μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物 核酸溶液 10μg(10μl)核酸 轉(zhuǎn)染試劑 20μl轉(zhuǎn)染試劑 三 操作步驟 下面以12.5μg的核酸與25μl轉(zhuǎn)染試劑，總注射體積100μl，20g小鼠尾靜脈注射為例說(shuō)明。局部注射不用稀釋，直接根據(jù)需要把核酸和轉(zhuǎn)染試劑混合即可使用。 1. 核酸的稀釋。將12.5μg核酸用適量無(wú)內(nèi)毒素純水稀釋成1μg/μl(如核酸原液濃度小，注射體積會(huì)增大)，加入12.5ul的水，再加入10%葡萄糖溶液(w/v)25μl，終體積50μl，充分混勻。 2. 轉(zhuǎn)染試劑的稀釋。取25μl的EntransterTM-in vivo試劑用25μl 的10%葡萄糖溶液稀釋，終體積為50μl，充分混勻。 3. 轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成。立即將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋后的核酸溶液中，充分混勻。 4. 室溫靜置15分鐘。配制好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物請(qǐng)即配即用，不宜長(zhǎng)期存放。 5. 動(dòng)物注射。 說(shuō)明：1).尾靜脈注射時(shí)請(qǐng)掌握注射技巧，一般選用遠(yuǎn)端1/3處?kù)o脈注射，如感覺(jué)到較強(qiáng)阻力，請(qǐng)停止注射，重新尋找靜脈進(jìn)行操作，不要強(qiáng)力推注，否則容易將藥液注射在尾部，導(dǎo)致尾部潰爛。注射完成后移去針頭，按壓針孔10秒以上，防止藥液流出。2). 0.625mg/kg的給藥劑量是起始給藥劑量，如果動(dòng)物可以耐受，可以按比例增加劑量；如果動(dòng)物不能耐受，可以適當(dāng)同比例減少劑量。3).局部注射，盡可能多注射藥液，有利于提高轉(zhuǎn)染效果。 6. 基因表達(dá)檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)注射方法和靶器官的差異，12-48小時(shí)后基因表達(dá)效果較好。 7. 長(zhǎng)期給藥。一次給藥的持續(xù)時(shí)間一般為1-2周，如果需要維持長(zhǎng)期效果，可以采用多次注射的方法。注射頻度一般為一周一次，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求縮短或適當(dāng)延長(zhǎng)。 四 常見問(wèn)題與解決方案 問(wèn)題 可能原因 解決方案 轉(zhuǎn)染復(fù)合物出現(xiàn)沉淀 核酸用TE等溶解 核酸用純水溶解 注射時(shí)的核酸終濃度過(guò)高 注射時(shí)的核酸終濃度<=0.5μg/μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物被凍存或低溫放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 轉(zhuǎn)染復(fù)合物最好即配即用 轉(zhuǎn)染水平低 給藥劑量低 在不造成動(dòng)物死亡前提下，提高給藥劑量 動(dòng)物有炎性反應(yīng)或死亡 注射操作有誤 將藥液正確注射到相應(yīng)部位 核酸用量過(guò)大 降低核酸用量，保持核酸和轉(zhuǎn)染試劑比例，同步降低轉(zhuǎn)染試劑用量。 注射液中含內(nèi)毒素 采用無(wú)內(nèi)毒素的核酸 注射前，采用0.22μm濾器過(guò)濾除菌 |
3樓2015-09-08 10:16:37
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1.核酸劑量。核酸尾靜脈給藥的起始劑量為0.625mg/kg。一般給藥劑量越高，效果越好，以不造成動(dòng)物炎癥和死亡為標(biāo)準(zhǔn)。下表是一些常見的給藥劑量和體積。 表1 給藥劑量和體積 給藥途徑 核酸用量 最大給藥體積 成年小鼠 尾靜脈 50-150μg 200μl-600μl 腦室 1-2.5μg 5μl 腹膜 100μg 0.6ml-1ml 睪丸 3-5μg 10μl 裸鼠 皮下腫瘤 10-50μg 100μl 成年大鼠 腦室 2-5μg 20μl 尾靜脈 500μg-2.25mg 1-2ml 成年兔 肺，氣管灌注 300-700μg 300-700μl 2.核酸的要求。建議用純水溶解，并且要高純度和無(wú)內(nèi)毒素。核酸的濃度建議在0.5-1ug/ul。核酸的純度會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率，一定要采用高純度高質(zhì)量核酸。 3. EntransterTM-in vivo的用量。一般情況下，核酸(μg)和EntransterTM-in vivo (μl)按照1:2的比例使用。 4.尾靜脈注射：需要用葡萄糖溶液稀釋。下表是采用0.625mg/kg情況下，尾靜脈注射20g體重小鼠，注射量為100μl時(shí)各成分組成（核酸濃度1μg/μl）。 表2 尾靜脈注射100ul轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成 100μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物 核酸稀釋液 12.5μg(12.5μl)核酸 12.5ul水 25μl的10%葡萄糖溶液 轉(zhuǎn)染試劑稀釋液 25μl轉(zhuǎn)染試劑 25μl的10%葡萄糖溶液 5.局部注射：首先確定需要最終注射的最大體積。最大體積確定后，根據(jù)核酸(μg)：轉(zhuǎn)染試劑(μl)=1:2來(lái)確定各用量，比如：局部注射量為30μl時(shí)各成分組成，其中核酸濃度1μg/μl（可以用生理鹽水或者純水溶解）。 表3 局部注射30ul轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成 30μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物 核酸溶液 10μg(10μl)核酸 轉(zhuǎn)染試劑 20μl轉(zhuǎn)染試劑 三 操作步驟 下面以12.5μg的核酸與25μl轉(zhuǎn)染試劑，總注射體積100μl，20g小鼠尾靜脈注射為例說(shuō)明。局部注射不用稀釋，直接根據(jù)需要把核酸和轉(zhuǎn)染試劑混合即可使用。 1. 核酸的稀釋。將12.5μg核酸用適量無(wú)內(nèi)毒素純水稀釋成1μg/μl(如核酸原液濃度小，注射體積會(huì)增大)，加入12.5ul的水，再加入10%葡萄糖溶液(w/v)25μl，終體積50μl，充分混勻。 2. 轉(zhuǎn)染試劑的稀釋。取25μl的EntransterTM-in vivo試劑用25μl 的10%葡萄糖溶液稀釋，終體積為50μl，充分混勻。 3. 轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成。立即將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋后的核酸溶液中，充分混勻。 4. 室溫靜置15分鐘。配制好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物請(qǐng)即配即用，不宜長(zhǎng)期存放。 5. 動(dòng)物注射。 說(shuō)明：1).尾靜脈注射時(shí)請(qǐng)掌握注射技巧，一般選用遠(yuǎn)端1/3處?kù)o脈注射，如感覺(jué)到較強(qiáng)阻力，請(qǐng)停止注射，重新尋找靜脈進(jìn)行操作，不要強(qiáng)力推注，否則容易將藥液注射在尾部，導(dǎo)致尾部潰爛。注射完成后移去針頭，按壓針孔10秒以上，防止藥液流出。2). 0.625mg/kg的給藥劑量是起始給藥劑量，如果動(dòng)物可以耐受，可以按比例增加劑量；如果動(dòng)物不能耐受，可以適當(dāng)同比例減少劑量。3).局部注射，盡可能多注射藥液，有利于提高轉(zhuǎn)染效果。 6. 基因表達(dá)檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)注射方法和靶器官的差異，12-48小時(shí)后基因表達(dá)效果較好。 7. 長(zhǎng)期給藥。一次給藥的持續(xù)時(shí)間一般為1-2周，如果需要維持長(zhǎng)期效果，可以采用多次注射的方法。注射頻度一般為一周一次，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求縮短或適當(dāng)延長(zhǎng)。 四 常見問(wèn)題與解決方案 問(wèn)題 可能原因 解決方案 轉(zhuǎn)染復(fù)合物出現(xiàn)沉淀 核酸用TE等溶解 核酸用純水溶解 注射時(shí)的核酸終濃度過(guò)高 注射時(shí)的核酸終濃度<=0.5μg/μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物被凍存或低溫放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 轉(zhuǎn)染復(fù)合物最好即配即用 轉(zhuǎn)染水平低 給藥劑量低 在不造成動(dòng)物死亡前提下，提高給藥劑量 動(dòng)物有炎性反應(yīng)或死亡 注射操作有誤 將藥液正確注射到相應(yīng)部位 核酸用量過(guò)大 降低核酸用量，保持核酸和轉(zhuǎn)染試劑比例，同步降低轉(zhuǎn)染試劑用量。 注射液中含內(nèi)毒素 采用無(wú)內(nèi)毒素的核酸 注射前，采用0.22μm濾器過(guò)濾除菌 |
4樓2015-09-08 13:31:58
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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關(guān)于Elite Fect-II體內(nèi)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)步驟 1. 計(jì)算siRNA需要的劑量：例如：小鼠20g，使用2mg/kg 的劑量，需要40μg的siRNA。 2.將一只小鼠需要的siRNA量溶于試劑C，溶解后的siRNA溶液總體積應(yīng)為75μl。注：不管使用siRNA的量是多少，siRNA溶解后，每只實(shí)驗(yàn)小鼠需要的siRNA溶液總體積應(yīng)為75μL。 3. 在另一個(gè)離心管里，加入試劑A。每10μg的siRNA，加1.5μl試劑A。然后加入試劑B，使其總體積達(dá)到20μL。注：不管siRNA用量，保持每只實(shí)驗(yàn)小鼠的A+B溶液總體積為20μl。 4. 將稀釋過(guò)的siRNA（步驟2）加入準(zhǔn)備好的試劑A＋B中（步驟3），輕彈管壁10次，立即混勻，（注：不要用移液器混勻）。此時(shí)，應(yīng)觀察到清涼的液體變渾濁。 5.混合液在室溫靜置2分鐘，然后加入120μL試劑D，并立即彈管壁10次混勻（注：每只小鼠總注射量為200μL），即可以進(jìn)行動(dòng)物尾靜脈注射（注：此時(shí)制備的試劑非常穩(wěn)定，在室溫下能放置超過(guò)2小時(shí)）�？梢岳眠@段時(shí)間，準(zhǔn)備其他動(dòng)物的試劑。 6.將每組動(dòng)物準(zhǔn)備好的試劑（步驟5）混合在一起，尾靜脈非常緩慢地注射，每只小鼠0.2ml。注射前動(dòng)物尾靜脈應(yīng)加熱，擴(kuò)張血管。 |
5樓2019-08-19 10:27:56
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